引用本文： 房心荷, 朱艳, 袁仕琴, 容维宁, 王晓光, 芮雪, 马美娇, 盛迅伦. Leber先天性黑矇患者不同基因新突变与临床表型分析. 中华眼底病杂志, 2022, 38(8): 668-674. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220406-00192 复制
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Leber先天性黑矇（LCA）是一种严重致盲性遗传性视网膜疾病，是导致儿童先天性早发性盲的首要疾病[1]。LCA多表现为常染色体隐性遗传，以眼球震颤、固视障碍、指压眼征为主要临床特征，视网膜电图（ERG）表现为明、暗适应振幅中重度降低甚至呈熄灭型，具有诊断意义[2]；部分患者可伴有小眼球、圆锥角膜、身体智力发育迟缓等综合征表现。LCA为单基因遗传眼病，目前已发现与其相关的致病基因28个，主要包括AIPL1、CEP290、 RDH12、 GUCY2D、CRB1、RPE65、RPGRIP1[3]。各种视网膜功能相关基因突变引起蛋白、细胞结构功能异常而导致视功能严重丧失[4]。国际罕见病研究联盟在其愿景中指出，到2020年，所有遗传疾病患者都应得到分子诊断[5]，目前大家系、多患者的遗传性疾病少见，利用传统的直接测序法检测效率低、耗时长、费用高，并且难以找到致病基因。对于小家系和散发患者，开发特异性高、覆盖率广的分子检测技术，做到优生诊断，是当下研究的重点和难点。本研究采用全基因组外显子测序技术对3个LCA家系患者进行了致病基因突变检测，借助共分离验证和生物信息学分析，明确其新致病基因突变位点，并初步分析与临床表型的关系。现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究经宁夏回族自治区人民医院伦理委员会审核（批准号：伦理[2021]-NZR-003）；遵循《赫尔辛基宣言》原则；未成年患儿监护人均获知情并签署书面知情同意书。
2021年1～12月于宁夏回族自治区人民医院眼科检查确诊的4例LCA患者和7名家系成员纳入本研究。4例患者来自3个无血缘关系家系。详细询问家族史、婚育史、全身疾病史，绘制家系图（图1）。患者及家系成员均行祼眼及最佳矫正视力（BCVA）、裂隙灯显微镜联合前置镜、眼底彩色照相、视野、光相干断层扫描（OCT）、全视野视网膜电图（ff-ERG）、眼底自身荧光（AF）检查。行荧光素眼底血管造影（FFA）1例。
图1
3个LCA患者家系图。1A～1C分别示家系1、2、3。□：健康男性； ○：健康女性； ■：患病男性； ●：患病女性；↗：先证者；参照文献[6-7]的标准确立LCA临床诊断标准：（1）6月龄以下视力严重损害或盲，伴固视障碍、眼球震颤或指压眼征；（2）ff-ERG a、b波振幅严重降低，甚至呈熄灭型；（3）视网膜广泛散在色素颗粒沉着，呈骨细胞样或“椒盐样”改变。
采集患者及家系成员外周静脉血6 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德国QIAGEN公司Qiamp Blood Mini Kit DNA提取试剂盒按照操作规程提取全基因组DNA，DNA质量浓度≥50 ng/μl，DNA总量≥6 μg。采用美国Agilent公司SureSelect外显子捕获试剂盒行全基因组外显子捕获；美国Illumina公司Illumina NextSeq 500平台进行高通量测序，测序深度100×。原始测序数据经Illumina Basecalling Software 1.7分析软件处理后，与美国国立生物技术信息中心（NCBI）人类基因组DNA参照序列（NCBI build 37.1）进行比对。采用SOAP（http://soap. genomics.org.cn）、BWA软件（http:// bio-bwa.sourceforge.net/）分别分析单核苷酸变异、插入和缺失变异的相关信息，获得全部变异位点。滤过最小等位基因频率（MAF）值＞1%的高频变异位点及对蛋白质功能和结构无影响的变异位点。经逐步过滤，筛选出家系内所有先证者共享的变异数，再过滤家系中无患病成员存在的变异，获得候选致病基因变异。对测序变异结果进行Sanger测序，验证得到的致病性突变位点，确保正常家系成员中呈现共分离。根据遗传规律，分析家族史，确立其遗传类型。
依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）2015年发布的《序列变异解读标准和指南》[8]对新发现突变位点进行致病等级评估。参考千人基因组计划数据库（http://browser. 1000genomes.org）、ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org/）东亚人种等位基因频率，MAF＜0.005作为排除良性变异的标准。应用Polyphen2（http://genetics.bwh. harvard.edu/pph2）、SIFT（http://sift.jcvi.org）、PROVEAN （http://provean.jcvi.org/index.php）、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org）蛋白预测软件分析错义变异对蛋白质功能的影响，以判断其致病性，进行致病性预测。运用GERP++（https://bio.tools/gerp）等网站衡量进化中跨物种基因序列的保守情况。Polyphen2、Mutation Taster软件对突变位点预测值范围均为0～1，分值越高越有害；氨基酸序列保守性GERP++预测值范围＞2表示比较保守，高分数意味着序列高度保守，因此改变是有害的。
2 结果
家系1先证者（Ⅱ-1），男，12岁，发病年龄出生后2个月。双眼眼球震颤。双眼祼眼视力均为数指，BCVA均为0.04；红绿色盲。眼底彩色照相检查，双眼眼底视盘边界清楚、颜色正常；黄斑中心凹反光可见，视网膜未见色素沉着。OCT检查，右眼黄斑区椭圆体带隆起呈强反射信号（图2A）；左眼无明显异常。眼底AF检查，视盘颞下方片状弱荧光区。FFA检查，双眼血管分支增多；右眼周边视网膜可见无灌注区伴毛细血管渗漏（图2B，2C）。ff-ERG检查，双眼明、暗适应振幅均重度下降。
图2
LCA家系1先证者眼部检查像。2A示右眼OCT像，右眼黄斑区椭圆体带隆起呈强反射信号；2B、2C分别示右眼、左眼FFA像，双眼视网膜血管分支增多，右眼周边视网膜可见无灌注区伴毛细血管渗漏。LCA：Leber先天性黑矇；OCT：光相干断层扫描；FFA：荧光素眼底血管造影
家系2先证者（Ⅱ-2），女，5岁，发病年龄4岁。指压眼征伴夜间视力差。双眼祼眼视力均为数指，BCVA均为0.2；全色盲。眼底视盘边界清楚、颜色淡，杯盘比0.3；黄斑中心凹反光可见，周边视网膜未见明显异常，无色素沉着（图3A）。OCT检查，视网膜层间隐约可见弱反射信号（图3B）。眼底AF检查，双眼黄斑区环状强荧光（图3C）。因患儿年龄小，FFA检查欠配合。ff-ERG检查，双眼明、暗适应振幅均重度下降。
图3
LCA家系2先证者眼部检查像。3A示左眼彩色眼底像，视盘边界清楚、颜色淡，黄斑中心凹反光可见，周边视网膜未见明显异常，无色素沉着；3B左眼OCT像，黄斑视网膜层间隐约可见弱反射信号；3C示左眼AF像，黄斑区环状强荧光。LCA：Leber先天性黑矇；OCT：光相干断层扫描；AF：自身荧光
家系3先证者（Ⅱ-1），女，18岁。双眼祼眼视力均为0.02，BCVA均为0.1。其妹妹（Ⅱ-2）8岁，双眼祼眼视力均为数指；BCVA右眼、左眼分别为0.25、0.10。先证者及其妹妹均自幼视物不清伴眼球震颤；全色盲。双眼眼底彩色照相、OCT检查均未见明显异常；ff-ERG明、暗适应振幅均重度下降。其妹妹双眼黄斑区AF增强（图4）。
图4
LCA家系3先证者妹妹AF像。4A、4B分别示先证者妹妹右眼、左眼AF像。双眼黄斑区荧光增强。LCA：Leber先天性黑矇；AF：自身荧光
全外显子测序结果显示，家系1先证者（Ⅱ-1）携带 PRPH2 基因c.640T＞A（p.C214S）（M1）纯合突变；其父亲（Ⅰ-1）、母亲（Ⅰ-2）该位点不存在突变（图5）。家系2先证者（Ⅱ-2）携带TULP1基因c.1256G＞A（p.R419Q）（M2）、c.1A＞C（p.M1L）（M3）复合杂合突变；其父亲（Ⅰ-1）、姐姐（Ⅱ-1）携带M2，母亲（Ⅰ-2）携带M3。家系3先证者（Ⅱ-1）及其妹妹（Ⅱ-2）携带GUCY2D基因c.1943T＞C（p.L648P）（M4）、c.380C＞T（p.P127L）（M5）复合杂合突变；其父亲（Ⅰ-1）、母亲（Ⅰ-2）分别携带M4、M5（图6）。经各软件分析上述突变均为致病突变，除M2外均为新发现突变位点（表1）。家系内基因型和疾病表型呈共分离。根据系谱及基因检测结果分析，3个家系均为常染色体隐性遗传。
图5
LCA家系1先证者及其父母基因Sanger测序图。5A示先证者，PRPH2基因c.640T＞A（p.C214S）纯合突变（黑箭）；5B、5C分别示其父亲、母亲，该位点不存在突变。LCA：Leber先天性黑矇
图6
LCA家系3先证者及其父母基因Sanger测序图。6A、6B示先证者，GUCY2D基因c.1943T＞C（p.L648P）（M4）、c.380C＞T（p.P127L）（M5）复合杂合突变；6C示先证者父亲，携带M4；6D示先证者母亲，携带M5。LCA：Leber先天性黑矇
表1
4例LCA患者基因检测结果
生物信息学分析结果显示，家系1先证者（Ⅱ-1）M1错义突变位于第2外显子。M1错义突变第640位核苷酸T突变为A，导致第214位氨基酸由半胱氨酸变为丝氨酸。该突变未见文献报道。在千人基因组计划数据库、ExAC数据库东亚人种中突变频率为0，为新发现突变位点。蛋白分析结果显示，Polyphen2软件评分为0.957 1，Mutation Taster软件评分为D，均为有害（表2）。根据ACMG指南，M1错义突变评为PS2，数据库中未发现该变异评为PM2，总致病性评分为PS2+PM2，为致病性变异。氨基酸保守性分析发现，M1突变位点在人、牛、小鼠、仓鼠等物种中高度保守（图7A）。
表2
PRPH2基因变异对其蛋白功能影响不同分析软件预测结果
图7
物种间序列保守性分析。7A示家系1，PRPH2 p.C214S所对应的第214位氨基酸序列位点在人、牛、小鼠和仓鼠等物种中高度保守（黑箭）；7B示家系2，TULP1 p.R419Q、p.M1L分别所对应的第419、1号氨基酸序列位点在人、猩猩、小鼠、野猪中高度保守（黑箭）；7C示家系3，GUCY2D p.L648P、p.P127L分别所对应的第648、127号氨基酸序列位点在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守（黑箭）
家系2先证者（Ⅱ-2）TULP1基因M2、M3错义突变分别位于第13、2外显子。M2错义突变第1 256位核苷酸G突变为A，导致第419位氨基酸由精氨酸转变为谷氨酸。M3错义突变第1位核苷酸由A突变为C，导致第1位氨基酸由蛋氨酸转变为亮氨酸。M2错义突变已被人类基因致病性突变数据库收录，M3在千人基因组计划数据库、ExAC数据库东亚人种中突变频率为0，为新发现突变位点（表3）。根据ACMG指南，M2错义突变评为PS1，符合家系共分离评为PP1，总致病性评分为PS1+PP1，为致病性变异；M3错义突变评为PVS1，数据库中未发现该变异评为PM2，符合家系共分离评为PP1，总致病性评分为PVS1+PM2+PP1，为致病性变异。氨基酸保守性分析发现，M2、M3突变位点在人、猩猩、小鼠、野猪中高度保守（图7B）。
表3
TULP1基因变异对其蛋白功能影响的不同分析软件预测结果
家系3先证者（Ⅱ-1）M4、M5错义突变分别位于第9、2外显子。M4错义突变第1 943位核苷酸T突变为C，导致第648位氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸；M5错义突变第380位核苷酸由C突变为T，导致第127位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸。M4、M5错义突变在千人基因组计划数据库、ExAC数据库东亚人种中突变频率为0，为新发现突变位点（表4）。根据ACMG指南，M4、M5错义突变评为PS2，数据库中未发现该变异评为PM2，符合家系共分离评为PP1，突变总致病性评分均为PS2+PM2+PP1，为致病性变异。氨基酸保守性分析发现，M4、M5突变位点在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守（图7C）。
表4
GUCY2D基因变异对其蛋白功能影响的不同分析软件预测结果
3 讨论
LCA是一种极易导致儿童失明的视网膜疾病[9]，患儿多于出生时或6月龄内即出现视力低下、无固视、眼球震颤、指压眼征、眼球内陷等。指压眼征可引起眶周脂肪萎缩并眼窝凹陷。眼底表现可完全正常，也可表现为黄斑“牛眼样”外观、后极部灰白色斑点改变等，部分患者直至病变晚期仍可保持正常眼底外观。ERG呈熄灭型或明、暗适应振幅重度下降，具有诊断意义。LCA临床表现复杂，症状及体征特异性不强，其他综合征或非综合征眼病也可有相似表现，临床上容易误诊为全色盲、不完全色盲、先天性静止性夜盲、白化病和视神经发育不全等[10]。2016年Minegishi等[11]等发现导致LCA的新突变基因CCT2，其也是涉及光感受器连接纤毛转运过程的基因。LCA具备临床表型多样性及遗传异质性特点，主要表现为不同的等位基因或基因突变可引起相似的临床表现[12]；但部分相同基因突变，发生在不同家系或不同位点时可有不同的临床表现[13]。
PRPH2基因导致的LCA分型为LCA18型（OMIM：608133）[14]。PRPH2基因导致LCA的发病机制目前尚不明确，既往多认为PRPH2基因主要导致视网膜色素变性（RP）[15]。Becirovic等[16]研究发现，PRPH2基因中的点突变与影响杆状和锥状光感受器的严重视网膜退行性疾病有关，其电生理检测明、暗适应振幅均呈显著性下降，与本研究PRPH2基因突变导致的家系1电生理检查结果一致。
TULP1是非综合征型视网膜纤毛疾病相关基因，由542个氨基酸（相对分子质量61×103）构成，主要在视网膜光感受器细胞表达，内节表达最丰富，对于视紫红质在光感受器内外节之间的转运具有重要作用。TULP1基因变异可导致LCA15型（MIM：613843）和RP14型（MIM：600132）[12]。LCA15型具有LCA的一般特点，疾病严重程度较轻，但发病年龄早，表型严重于RP。Patel等[17]报道，TULP1基因错义突变c.1256G＞A （p.Arg419Gln）可引起视网膜营养不良。本研究家系2先证者c.1256G＞A错义突变引起的蛋白质变化p.R419Q，与Patel等[17]报道的蛋白质变化不同，导致的疾病也不同。相同位点的同种突变类型导致的疾病不同，我们考虑家系2为TULP1基因新突变位点（c.1A＞C）与已知突变位点（c.1256G＞A）的结合，从而引起蛋白结构功能发生变化。家系中先证者姐姐（Ⅱ-1）携带等位基因1突变c.1256G＞A（p.R419Q），眼部表型正常，其原因可能为2个突变共同构成复合杂合性突变是本家系的致病原因。该家系成员TULP1基因2个位点同时变异才表现出临床症状。
GUCY2D基因编码鸟苷酸环化酶，由1 103个氨基酸（相对分子质量120×103）构成，以跨膜蛋白的形式于光感受器细胞外节存在，其环磷酸鸟苷（cGMP）由三磷酸鸟苷催化转变，cGMP门控离子通道得以开放，Ca2+、Na+细胞内流，光照射后恢复暗态。GUCY2D基因突变可导致LCA1型（MIM：204000）。其发病特点为视力严重损害，眼底通常无明显病变，畏光明显[18]。本研究中家系3先证者及其妹妹均为GUCY2D基因第9外显子c.1943T＞C（p.L648P）和第2外显子c.380C＞T（p.P127L）发生复合杂合错义突变，眼底多为正常，但视功能损害严重，伴眼球震颤且为全色盲。
本研究从LCA的临床表现和遗传变异水平阐明了3个不同家系患者的致病原因，报道了导致LCA的新发变异，进一步扩充了LCA的突变位点，扩大了LCA基因突变频谱，使该病的分子病理机制得到了进一步理解，为LCA精确诊断、遗传咨询和产前诊断以及可能的基因治疗提供了理论依据。同时也说明二代测序技术对此类疾病具有重要的辅助诊断意义。LCA具备临床表型多样性及遗传异质性的特点，本研究的有限病例并不能涵盖本病的一般情况，且患者多为幼儿，很多其他系统的病变尚未显现，可能某些患者在未来会出现综合征表现，还需加强随访和评估。
Leber先天性黑矇（LCA）是一种严重致盲性遗传性视网膜疾病，是导致儿童先天性早发性盲的首要疾病[1]。LCA多表现为常染色体隐性遗传，以眼球震颤、固视障碍、指压眼征为主要临床特征，视网膜电图（ERG）表现为明、暗适应振幅中重度降低甚至呈熄灭型，具有诊断意义[2]；部分患者可伴有小眼球、圆锥角膜、身体智力发育迟缓等综合征表现。LCA为单基因遗传眼病，目前已发现与其相关的致病基因28个，主要包括AIPL1、CEP290、 RDH12、 GUCY2D、CRB1、RPE65、RPGRIP1[3]。各种视网膜功能相关基因突变引起蛋白、细胞结构功能异常而导致视功能严重丧失[4]。国际罕见病研究联盟在其愿景中指出，到2020年，所有遗传疾病患者都应得到分子诊断[5]，目前大家系、多患者的遗传性疾病少见，利用传统的直接测序法检测效率低、耗时长、费用高，并且难以找到致病基因。对于小家系和散发患者，开发特异性高、覆盖率广的分子检测技术，做到优生诊断，是当下研究的重点和难点。本研究采用全基因组外显子测序技术对3个LCA家系患者进行了致病基因突变检测，借助共分离验证和生物信息学分析，明确其新致病基因突变位点，并初步分析与临床表型的关系。现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究经宁夏回族自治区人民医院伦理委员会审核（批准号：伦理[2021]-NZR-003）；遵循《赫尔辛基宣言》原则；未成年患儿监护人均获知情并签署书面知情同意书。
2021年1～12月于宁夏回族自治区人民医院眼科检查确诊的4例LCA患者和7名家系成员纳入本研究。4例患者来自3个无血缘关系家系。详细询问家族史、婚育史、全身疾病史，绘制家系图（图1）。患者及家系成员均行祼眼及最佳矫正视力（BCVA）、裂隙灯显微镜联合前置镜、眼底彩色照相、视野、光相干断层扫描（OCT）、全视野视网膜电图（ff-ERG）、眼底自身荧光（AF）检查。行荧光素眼底血管造影（FFA）1例。
图1
3个LCA患者家系图。1A～1C分别示家系1、2、3。□：健康男性； ○：健康女性； ■：患病男性； ●：患病女性；↗：先证者；参照文献[6-7]的标准确立LCA临床诊断标准：（1）6月龄以下视力严重损害或盲，伴固视障碍、眼球震颤或指压眼征；（2）ff-ERG a、b波振幅严重降低，甚至呈熄灭型；（3）视网膜广泛散在色素颗粒沉着，呈骨细胞样或“椒盐样”改变。
采集患者及家系成员外周静脉血6 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德国QIAGEN公司Qiamp Blood Mini Kit DNA提取试剂盒按照操作规程提取全基因组DNA，DNA质量浓度≥50 ng/μl，DNA总量≥6 μg。采用美国Agilent公司SureSelect外显子捕获试剂盒行全基因组外显子捕获；美国Illumina公司Illumina NextSeq 500平台进行高通量测序，测序深度100×。原始测序数据经Illumina Basecalling Software 1.7分析软件处理后，与美国国立生物技术信息中心（NCBI）人类基因组DNA参照序列（NCBI build 37.1）进行比对。采用SOAP（http://soap. genomics.org.cn）、BWA软件（http:// bio-bwa.sourceforge.net/）分别分析单核苷酸变异、插入和缺失变异的相关信息，获得全部变异位点。滤过最小等位基因频率（MAF）值＞1%的高频变异位点及对蛋白质功能和结构无影响的变异位点。经逐步过滤，筛选出家系内所有先证者共享的变异数，再过滤家系中无患病成员存在的变异，获得候选致病基因变异。对测序变异结果进行Sanger测序，验证得到的致病性突变位点，确保正常家系成员中呈现共分离。根据遗传规律，分析家族史，确立其遗传类型。
依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）2015年发布的《序列变异解读标准和指南》[8]对新发现突变位点进行致病等级评估。参考千人基因组计划数据库（http://browser. 1000genomes.org）、ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org/）东亚人种等位基因频率，MAF＜0.005作为排除良性变异的标准。应用Polyphen2（http://genetics.bwh. harvard.edu/pph2）、SIFT（http://sift.jcvi.org）、PROVEAN （http://provean.jcvi.org/index.php）、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org）蛋白预测软件分析错义变异对蛋白质功能的影响，以判断其致病性，进行致病性预测。运用GERP++（https://bio.tools/gerp）等网站衡量进化中跨物种基因序列的保守情况。Polyphen2、Mutation Taster软件对突变位点预测值范围均为0～1，分值越高越有害；氨基酸序列保守性GERP++预测值范围＞2表示比较保守，高分数意味着序列高度保守，因此改变是有害的。
2 结果
家系1先证者（Ⅱ-1），男，12岁，发病年龄出生后2个月。双眼眼球震颤。双眼祼眼视力均为数指，BCVA均为0.04；红绿色盲。眼底彩色照相检查，双眼眼底视盘边界清楚、颜色正常；黄斑中心凹反光可见，视网膜未见色素沉着。OCT检查，右眼黄斑区椭圆体带隆起呈强反射信号（图2A）；左眼无明显异常。眼底AF检查，视盘颞下方片状弱荧光区。FFA检查，双眼血管分支增多；右眼周边视网膜可见无灌注区伴毛细血管渗漏（图2B，2C）。ff-ERG检查，双眼明、暗适应振幅均重度下降。
图2
LCA家系1先证者眼部检查像。2A示右眼OCT像，右眼黄斑区椭圆体带隆起呈强反射信号；2B、2C分别示右眼、左眼FFA像，双眼视网膜血管分支增多，右眼周边视网膜可见无灌注区伴毛细血管渗漏。LCA：Leber先天性黑矇；OCT：光相干断层扫描；FFA：荧光素眼底血管造影
家系2先证者（Ⅱ-2），女，5岁，发病年龄4岁。指压眼征伴夜间视力差。双眼祼眼视力均为数指，BCVA均为0.2；全色盲。眼底视盘边界清楚、颜色淡，杯盘比0.3；黄斑中心凹反光可见，周边视网膜未见明显异常，无色素沉着（图3A）。OCT检查，视网膜层间隐约可见弱反射信号（图3B）。眼底AF检查，双眼黄斑区环状强荧光（图3C）。因患儿年龄小，FFA检查欠配合。ff-ERG检查，双眼明、暗适应振幅均重度下降。
图3
LCA家系2先证者眼部检查像。3A示左眼彩色眼底像，视盘边界清楚、颜色淡，黄斑中心凹反光可见，周边视网膜未见明显异常，无色素沉着；3B左眼OCT像，黄斑视网膜层间隐约可见弱反射信号；3C示左眼AF像，黄斑区环状强荧光。LCA：Leber先天性黑矇；OCT：光相干断层扫描；AF：自身荧光
家系3先证者（Ⅱ-1），女，18岁。双眼祼眼视力均为0.02，BCVA均为0.1。其妹妹（Ⅱ-2）8岁，双眼祼眼视力均为数指；BCVA右眼、左眼分别为0.25、0.10。先证者及其妹妹均自幼视物不清伴眼球震颤；全色盲。双眼眼底彩色照相、OCT检查均未见明显异常；ff-ERG明、暗适应振幅均重度下降。其妹妹双眼黄斑区AF增强（图4）。
图4
LCA家系3先证者妹妹AF像。4A、4B分别示先证者妹妹右眼、左眼AF像。双眼黄斑区荧光增强。LCA：Leber先天性黑矇；AF：自身荧光
全外显子测序结果显示，家系1先证者（Ⅱ-1）携带 PRPH2 基因c.640T＞A（p.C214S）（M1）纯合突变；其父亲（Ⅰ-1）、母亲（Ⅰ-2）该位点不存在突变（图5）。家系2先证者（Ⅱ-2）携带TULP1基因c.1256G＞A（p.R419Q）（M2）、c.1A＞C（p.M1L）（M3）复合杂合突变；其父亲（Ⅰ-1）、姐姐（Ⅱ-1）携带M2，母亲（Ⅰ-2）携带M3。家系3先证者（Ⅱ-1）及其妹妹（Ⅱ-2）携带GUCY2D基因c.1943T＞C（p.L648P）（M4）、c.380C＞T（p.P127L）（M5）复合杂合突变；其父亲（Ⅰ-1）、母亲（Ⅰ-2）分别携带M4、M5（图6）。经各软件分析上述突变均为致病突变，除M2外均为新发现突变位点（表1）。家系内基因型和疾病表型呈共分离。根据系谱及基因检测结果分析，3个家系均为常染色体隐性遗传。
图5
LCA家系1先证者及其父母基因Sanger测序图。5A示先证者，PRPH2基因c.640T＞A（p.C214S）纯合突变（黑箭）；5B、5C分别示其父亲、母亲，该位点不存在突变。LCA：Leber先天性黑矇
图6
LCA家系3先证者及其父母基因Sanger测序图。6A、6B示先证者，GUCY2D基因c.1943T＞C（p.L648P）（M4）、c.380C＞T（p.P127L）（M5）复合杂合突变；6C示先证者父亲，携带M4；6D示先证者母亲，携带M5。LCA：Leber先天性黑矇
表1
4例LCA患者基因检测结果
生物信息学分析结果显示，家系1先证者（Ⅱ-1）M1错义突变位于第2外显子。M1错义突变第640位核苷酸T突变为A，导致第214位氨基酸由半胱氨酸变为丝氨酸。该突变未见文献报道。在千人基因组计划数据库、ExAC数据库东亚人种中突变频率为0，为新发现突变位点。蛋白分析结果显示，Polyphen2软件评分为0.957 1，Mutation Taster软件评分为D，均为有害（表2）。根据ACMG指南，M1错义突变评为PS2，数据库中未发现该变异评为PM2，总致病性评分为PS2+PM2，为致病性变异。氨基酸保守性分析发现，M1突变位点在人、牛、小鼠、仓鼠等物种中高度保守（图7A）。
表2
PRPH2基因变异对其蛋白功能影响不同分析软件预测结果
图7
物种间序列保守性分析。7A示家系1，PRPH2 p.C214S所对应的第214位氨基酸序列位点在人、牛、小鼠和仓鼠等物种中高度保守（黑箭）；7B示家系2，TULP1 p.R419Q、p.M1L分别所对应的第419、1号氨基酸序列位点在人、猩猩、小鼠、野猪中高度保守（黑箭）；7C示家系3，GUCY2D p.L648P、p.P127L分别所对应的第648、127号氨基酸序列位点在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守（黑箭）
家系2先证者（Ⅱ-2）TULP1基因M2、M3错义突变分别位于第13、2外显子。M2错义突变第1 256位核苷酸G突变为A，导致第419位氨基酸由精氨酸转变为谷氨酸。M3错义突变第1位核苷酸由A突变为C，导致第1位氨基酸由蛋氨酸转变为亮氨酸。M2错义突变已被人类基因致病性突变数据库收录，M3在千人基因组计划数据库、ExAC数据库东亚人种中突变频率为0，为新发现突变位点（表3）。根据ACMG指南，M2错义突变评为PS1，符合家系共分离评为PP1，总致病性评分为PS1+PP1，为致病性变异；M3错义突变评为PVS1，数据库中未发现该变异评为PM2，符合家系共分离评为PP1，总致病性评分为PVS1+PM2+PP1，为致病性变异。氨基酸保守性分析发现，M2、M3突变位点在人、猩猩、小鼠、野猪中高度保守（图7B）。
表3
TULP1基因变异对其蛋白功能影响的不同分析软件预测结果
家系3先证者（Ⅱ-1）M4、M5错义突变分别位于第9、2外显子。M4错义突变第1 943位核苷酸T突变为C，导致第648位氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸；M5错义突变第380位核苷酸由C突变为T，导致第127位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸。M4、M5错义突变在千人基因组计划数据库、ExAC数据库东亚人种中突变频率为0，为新发现突变位点（表4）。根据ACMG指南，M4、M5错义突变评为PS2，数据库中未发现该变异评为PM2，符合家系共分离评为PP1，突变总致病性评分均为PS2+PM2+PP1，为致病性变异。氨基酸保守性分析发现，M4、M5突变位点在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守（图7C）。
表4
GUCY2D基因变异对其蛋白功能影响的不同分析软件预测结果
3 讨论
LCA是一种极易导致儿童失明的视网膜疾病[9]，患儿多于出生时或6月龄内即出现视力低下、无固视、眼球震颤、指压眼征、眼球内陷等。指压眼征可引起眶周脂肪萎缩并眼窝凹陷。眼底表现可完全正常，也可表现为黄斑“牛眼样”外观、后极部灰白色斑点改变等，部分患者直至病变晚期仍可保持正常眼底外观。ERG呈熄灭型或明、暗适应振幅重度下降，具有诊断意义。LCA临床表现复杂，症状及体征特异性不强，其他综合征或非综合征眼病也可有相似表现，临床上容易误诊为全色盲、不完全色盲、先天性静止性夜盲、白化病和视神经发育不全等[10]。2016年Minegishi等[11]等发现导致LCA的新突变基因CCT2，其也是涉及光感受器连接纤毛转运过程的基因。LCA具备临床表型多样性及遗传异质性特点，主要表现为不同的等位基因或基因突变可引起相似的临床表现[12]；但部分相同基因突变，发生在不同家系或不同位点时可有不同的临床表现[13]。
PRPH2基因导致的LCA分型为LCA18型（OMIM：608133）[14]。PRPH2基因导致LCA的发病机制目前尚不明确，既往多认为PRPH2基因主要导致视网膜色素变性（RP）[15]。Becirovic等[16]研究发现，PRPH2基因中的点突变与影响杆状和锥状光感受器的严重视网膜退行性疾病有关，其电生理检测明、暗适应振幅均呈显著性下降，与本研究PRPH2基因突变导致的家系1电生理检查结果一致。
TULP1是非综合征型视网膜纤毛疾病相关基因，由542个氨基酸（相对分子质量61×103）构成，主要在视网膜光感受器细胞表达，内节表达最丰富，对于视紫红质在光感受器内外节之间的转运具有重要作用。TULP1基因变异可导致LCA15型（MIM：613843）和RP14型（MIM：600132）[12]。LCA15型具有LCA的一般特点，疾病严重程度较轻，但发病年龄早，表型严重于RP。Patel等[17]报道，TULP1基因错义突变c.1256G＞A （p.Arg419Gln）可引起视网膜营养不良。本研究家系2先证者c.1256G＞A错义突变引起的蛋白质变化p.R419Q，与Patel等[17]报道的蛋白质变化不同，导致的疾病也不同。相同位点的同种突变类型导致的疾病不同，我们考虑家系2为TULP1基因新突变位点（c.1A＞C）与已知突变位点（c.1256G＞A）的结合，从而引起蛋白结构功能发生变化。家系中先证者姐姐（Ⅱ-1）携带等位基因1突变c.1256G＞A（p.R419Q），眼部表型正常，其原因可能为2个突变共同构成复合杂合性突变是本家系的致病原因。该家系成员TULP1基因2个位点同时变异才表现出临床症状。
GUCY2D基因编码鸟苷酸环化酶，由1 103个氨基酸（相对分子质量120×103）构成，以跨膜蛋白的形式于光感受器细胞外节存在，其环磷酸鸟苷（cGMP）由三磷酸鸟苷催化转变，cGMP门控离子通道得以开放，Ca2+、Na+细胞内流，光照射后恢复暗态。GUCY2D基因突变可导致LCA1型（MIM：204000）。其发病特点为视力严重损害，眼底通常无明显病变，畏光明显[18]。本研究中家系3先证者及其妹妹均为GUCY2D基因第9外显子c.1943T＞C（p.L648P）和第2外显子c.380C＞T（p.P127L）发生复合杂合错义突变，眼底多为正常，但视功能损害严重，伴眼球震颤且为全色盲。
本研究从LCA的临床表现和遗传变异水平阐明了3个不同家系患者的致病原因，报道了导致LCA的新发变异，进一步扩充了LCA的突变位点，扩大了LCA基因突变频谱，使该病的分子病理机制得到了进一步理解，为LCA精确诊断、遗传咨询和产前诊断以及可能的基因治疗提供了理论依据。同时也说明二代测序技术对此类疾病具有重要的辅助诊断意义。LCA具备临床表型多样性及遗传异质性的特点，本研究的有限病例并不能涵盖本病的一般情况，且患者多为幼儿，很多其他系统的病变尚未显现，可能某些患者在未来会出现综合征表现，还需加强随访和评估。
