引用本文： 罗云枫, 倪焰, 栾洁. 瘦素对胰岛素抵抗状态下人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响. 中华眼底病杂志, 2014, 30(2): 161-165. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.02.011 复制
胰岛素抵抗是代谢综合征(MS)发病的中心环节和基本致病基础[1]，其引起的氧化应激可导致血管炎症反应以及内皮细胞功能紊乱而导致各种全身性病变。MS对于视网膜血管的功能和代谢的影响主要是能引起视网膜的糖尿病视网膜病变(DR)[2, 3]。腹型肥胖是MS的临床表现和诊断标准之一[4]。脂肪细胞因子可直接或者间接地负性调节胰岛素信号转导，导致机体出现胰岛素抵抗及其相关疾病，瘦素是脂肪细胞因子之一。有临床研究发现，胰岛素抵抗患者的DR发生高于无胰岛素抵抗患者。但是否与脂肪因子的分泌有关目前尚不清楚。本研究通过观察不同浓度瘦素(leptin)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化损伤和修复的影响，探讨瘦素在DR发生发展中的作用，现将结果报道如下。
1 材料和方法
Leptin human L4146(美国Sigma公司)；人RPE细胞株(ARPE-19, 美国ATCC公司)；葡萄糖(南京凯基生物科技发展有限公司)；胰岛素(生物合成人胰岛素注射液；诺和诺德制药有限公司)；Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)/F12培养基，胎牛血清，胰蛋白酶(美国Gibco公司)；鼠抗人8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)单克隆抗体(美国Trevigen公司)；鼠抗人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(hOGG1)单克隆抗体(美国Assay Designs公司)；细胞内氧化应激活性氧(ROS)初级荧光测定试剂盒(上海杰美基因医药有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所)；3-(4, 5-二甲基噻唑2)-2, 5-二苯基四氮唑嗅盐(MTT)(美国Sigma公司)；医用净化工作台(吴江市净化设备总厂)；流式细胞仪(美国FACS Calibur Becton-Dickinson公司)；酶标仪(model 860，BIO-RAD，美国MDC公司)；电泳仪(DYY-5型，北京市六一仪器厂)，正置荧光显微镜(Scope A1，德国Zeiss公司)。
人RPE细胞培养。ARPE-19细胞复苏，细胞融合密度达80%后，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，加入胰酶消化液(0.05%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸)2 ml，倒置相差显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆、细胞间隙变大或少量细胞脱壁漂移时，加入含血清的培养液终止消化，收集细胞悬液，离心半径7.5 cm，1000 r/min离心10 min，将细胞吹打均匀，计数，接种于25 cm2培养瓶中，按1:4至1:6传代，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每周换液2～3次，直至细胞融合。取4～6代80%融合细胞用于实验。
实验分组。将体外培养ARPE-19细胞随机分为成正常对照组、胰岛素抵抗组[4]。正常对照组加入DMEM／F12培养液，胰岛素抵抗组加含30 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰岛素的DMEM／F12培养液。
2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞内ROS水平。正常对照组、胰岛素抵抗组分别加入0、10、100 ng/ml瘦素，干预后24、48、72 h，应用ROS检测试剂盒，按照说明书流程操作。波长488 nm的流式细胞仪计数50 000个细胞，检测平均荧光强度以反映细胞内ROS水平。
免疫细胞化学(ICG)法检测细胞内8-OHdG的表达[5]。以细胞浆呈棕黄色或细胞核、细胞浆同时呈棕黄色为阳性，以细胞核、细胞浆均无着色为阴性。根据阳性细胞着色面积和着色强度积分，应用Image-pro plus图像分析软件进行分析。
蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测hOGG1表达。将各组RPE细胞提取蛋白，BCA法对上清蛋白进行定量。各取出20 μg总蛋白，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印(53 V，60 mA)。封闭过夜。一抗(1:2000鼠抗人hOGG1单克隆抗体)4 ℃过夜。二抗(1:10 000HRP标记的羊抗鼠IgG)室温摇床孵育1 h。电化学发光法显色，凝胶图像分析仪扫描图像。应用Band Scan 5.0图像分析软件读取胶片上各蛋白条带的灰度值，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，以目的蛋白和β-actin条带密度的比值表示目的蛋白的相对含量。
SPSS17.0统计软件包进行统计学分析处理。上述每组实验均重复4次；采用描述性统计分析。计量资料用均数±标准差(
2 结果
DCFH-DA法检测结果显示，干预后24、48、72 h，正常对照组(F=37.136、37.178、49.634)和胰岛素抵抗组(F=9.822、28.881、71.150)RPE细胞ROS表达均随瘦素浓度增加而增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中，胰岛素抵抗组在干预后24 h，RPE细胞ROS的表达量随着瘦素浓度的增加递增，0 ng/ml浓度瘦素干预与10、100 ng/ml浓度瘦素干预之间RPE细胞ROS表达量比较，差异均有统计学意义(F=46.077，P＜0.05)；10 ng/ml浓度瘦素干预与100 ng/ml浓度瘦素干预之间RPE细胞ROS表达量比较，差异无统计学意义(F=6.077，P＞0.05)(图 1)。随干预时间延长，100 ng/ml浓度瘦素干预RPE细胞ROS表达量均升高，差异有统计学意义(F=14.998，P＜0.05)(图 1)。干预后24、48 h，10(F=8.035、7.983)、100 ng/ml浓度瘦素(F=8.063、7.932)正常对照组和胰岛素抵抗组之间RPE细胞ROS表达量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；干预后72 h，胰岛素抵抗组RPE细胞ROS表达量高于正常对照组RPE细胞ROS表达量，差异有统计学意义(F=39.213，P＜0.05)(图 2)。
图1
不同浓度瘦素对人RPE细胞ROS表达的影响。*：与0 ng/ml浓度瘦素比较，P＜0.05
图2
相同浓度瘦素干预下正常组、胰岛素抵抗组RPE细胞ROS表达量。*：与对照组比较，P＜0.05
ICG法检测结果显示，8-OHdG阳性定位于细胞浆和(或)细胞核，呈棕黄色。干预后24、48、72 h，10、100 ng/ml浓度瘦素干预后，正常对照组和胰岛素抵抗组RPE细胞内均有8-OHdG的表达(图 3，4)。
图3
正常对照组RPE细胞ICG染色像。3A~3C.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后24 h；3D~3F.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后48 h；3G~3I.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后72 h。RPE细胞内均有8-OHdG的表达。0、10 ng/ml浓度瘦素ICG ×400，100 ng/ml浓度瘦素ICG ×800 图 4 胰岛素抵抗组RPE细胞ICG染色像。4A~4C.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后24 h；4D~4F.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后48 h；4G~4I.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后72 h。RPE细胞内均有8-OHdG的表达。0、10 ng/ml浓度瘦素ICG ×400，100 ng/ml浓度瘦素ICG ×800 图 5 不同浓度瘦素对人RPE细胞8-OHdG表达的影响。*:与0 ng/ml浓度比较，P＜0.05 图 6 相同浓度瘦素干预下不同时间点人RPE细胞8-OHdG表达量。*:与干预后24 h比较，P＜0.05 图 7 相同浓度瘦素干预下两组人RPE细胞8-OHdG表达量。*:与对照组比较，P＜0.05 图 8 不同浓度瘦素对人RPE细胞hOGG1表达的影响。*:与0 ng/ml浓度比较，P＜0.05
干预后24、48、72 h，正常对照组(F=88.643、390.920、1039.276)和胰岛素抵抗组(F=273.311、299.155、82.237)RPE细胞8-OHdG的表达随瘦素浓度增加而增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中，正常对照组100 ng/ml浓度瘦素干预后，RPE细胞8-OHdG表达量随干预时间延长而增高，差异均有统计学意义(F=79.823, P＜0.05)(图 5)。胰岛素抵抗组10 ng/ml浓度瘦素干预后72 h的RPE细胞8-OHdG表达量高于干预后24、48 h，差异有统计学意义(F=309.623，P＜0.05)；100 ng/ml浓度瘦素干预后，RPE细胞8-OHdG表达量随干预时间延长有升高趋势，但差异无统计学意义(F=15.389，P＞0.05)(图 6)。10 ng/ml浓度瘦素干预后24、72 h，胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量高于正常对照组，差异有统计学意义(F=157.199、1183.004，P＜0.05)；干预后48 h，正常对照组、胰岛素抵抗组PRE细胞8-OHdG表达量比较，差异无统计学意义(F=9.089，P＞0.05)。100 ng/ml浓度瘦素干预后24、48 h，胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量高于正常对照组，差异有统计学意义(F=52.408、167.983，P＜0.05)(图 7)；干预后72 h，正常对照组、胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量比较，差异无统计学意义(F=34.527，P＞0.05)。
Western blot检测结果显示，干预后24、48、72 h，正常对照组(F=470.062、1073.113、295.456)、胰岛素抵抗组(F=240.032、592.389、527.760)RPE细胞hOGGl表达量均随瘦素浓度增加递增，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 8, 9)；在相同浓度瘦素干预下，随着时间延长，RPE细胞hOGG1表达量呈现先升高后降低的趋势。干预后48 h，正常对照组(F=83.673、268.000、373.492)、胰岛素抵抗组(F=49.021、304.293、294.293)RPE细胞hOGGl表达量均高于干预后24、72hRPE细胞hOGGl表达量，差异有统计学意义(P＜0.05)。
图9
Western blot图。9A.正常对照组。9B.胰岛素抵抗组。1~3：0、10、100 ng/ml。不同浓度瘦素干预下RPE细胞内hOGGl的表达量
10 ng/ml浓度瘦素干预后24 h，胰岛素抵抗组、正常对照组RPE细胞hOGGl表达量比较，差异无统计学意义(F=23.392，P＞0.05)；干预后48、72 h，胰岛素抵抗组RPE细胞hOGGl表达量低于正常对照组，差异有统计学意义(F=293.392、129.394，P＜0.05)。100 ng/ml浓度瘦素干预24 h，胰岛素抵抗组、正常对照组RPE细胞hOGGl表达量比较，差异无统计学意义(F=9.023，P＞0.05)；干预后48 h，正常对照组RPE细胞hOGGl表达量低于胰岛素抵抗组，差异有统计学意义(F=593.02，P＜0.05)；干预后72 h，胰岛素抵抗组RPE细胞hOGGl表达量低于正常对照组，差异有统计学意义(F=329.89，P＜0.05)。
3 讨论
有临床研究发现，胰岛素抵抗患者的DR发生高于无胰岛素抵抗患者，但是否与脂肪因子的分泌有关目前尚不清楚[6]。瘦素是一种脂肪因子，免疫组织化学研究发现，在糖尿病患者的视网膜外纤维血管组织的视网膜前膜组织中检测出了瘦素效应受体长型受体中存在着瘦素和瘦素受体，在增生型DR(PDR)患者的表达[7]，而对正常人的视网膜组织进行相同的检测却并未检测到它的表达。同时还有研究发现，在PDR患者的玻璃体液中瘦素浓度显著高于正常人，既使把体重指数对瘦素水平的影响去除后结果也如此。体外实验已证明，瘦素在PDR患者玻璃体液中的平均浓度已能够有效地促进新生血管的形成[8]。这些均提示瘦素是促进PDR的发生发展的直接因素之一。瘦素在DR的发生发展过程中究竟如何发挥作用？这是本研究想要探讨的问题。统一机制学说认为氧化应激是DR发生发展过程中的重要因素[6]，RPE细胞因分泌内源性抗新生血管因子色素上皮衍生因子而在抗新生血管生成中发挥着重要作用，因此我们选择了RPE细胞做为研究对象，模拟胰岛素抵抗环境，观察瘦素对RPE细胞氧化损伤的影响。
ROS被认为是引起DNA氧化损伤的主要因素之一，而ROS可使鸟嘌呤(G)氧化为8-OHdG，在体内形成后较为稳定、易于检测，被视为DNA氧化损伤的生物标志物。本研究结果显示，无论在正常状态还是胰岛素抵抗状态下，RPE细胞内ROS、8-OHdG的表达量均随着瘦素浓度增加而增加，差异具有统计学意义；而在相同瘦素浓度的干预下，两组RPE细胞内ROS、8-OHdG的表达量呈现胰岛素抵抗组高于正常对照组的趋势，虽然在干预后24、48 h时两组RPE细胞内ROS的表达的差异不具有统计学意义，仍提示无论是正常状态还是胰岛素抵抗状态下，瘦素均能诱发人RPE细胞的氧化损伤，而在胰岛素抵抗状态下，瘦素诱发的人RPE细胞的氧化损伤程度更重。
正常细胞具有多种应对氧化损伤的机制，哺乳动物中负责DNA链8-OHdG突变修复的主要DNA糖基化酶之一是8-羟基鸟嘌呤糖基化酶(OGG)，人类的称为hOGG[9]。本研究结果显示，两组RPE细胞内hOGGl的表达量均随瘦素浓度的增加递增，差异有统计学意义；在相同浓度瘦素干预下，两组RPE细胞内hOGGl的表达均显示干预后48 h时高于干预后24、72 h时。因此我们推测，瘦素在诱发RPE细胞氧化损伤的同时，启动了氧化损伤的代偿性修复，但随着时间的延长及氧化损伤程度的加重，氧化损伤的修复能力下降。另外，我们还发现以10 ng/ml浓度瘦素干预的两组RPE细胞内hOGG1表达量呈现胰岛素抵抗组低于正常对照组的趋势；而以100 ng/ml浓度瘦素干预的两组RPE细胞内hOGG1表达量干预后48 h时正常对照组低于胰岛素抵抗组，差异有统计学意义；干预后72 h时胰岛素抵抗组低于正常对照组，差异有统计学意义；提示针对瘦素引起的氧化损伤，胰岛素抵抗状态下的RPE细胞更易发挥代偿性氧化损伤修复的作用，但随着氧化损伤的加重，胰岛素抵抗状态下的RPE细胞更易发生氧化损伤修复失代偿。
由于并未观察瘦素是否对与DR发生直接相关的视网膜血管内皮细胞或周细胞产生氧化损伤，本研究结果对探讨瘦素在DR发生发展中的作用尚有局限性。
胰岛素抵抗是代谢综合征(MS)发病的中心环节和基本致病基础[1]，其引起的氧化应激可导致血管炎症反应以及内皮细胞功能紊乱而导致各种全身性病变。MS对于视网膜血管的功能和代谢的影响主要是能引起视网膜的糖尿病视网膜病变(DR)[2, 3]。腹型肥胖是MS的临床表现和诊断标准之一[4]。脂肪细胞因子可直接或者间接地负性调节胰岛素信号转导，导致机体出现胰岛素抵抗及其相关疾病，瘦素是脂肪细胞因子之一。有临床研究发现，胰岛素抵抗患者的DR发生高于无胰岛素抵抗患者。但是否与脂肪因子的分泌有关目前尚不清楚。本研究通过观察不同浓度瘦素(leptin)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化损伤和修复的影响，探讨瘦素在DR发生发展中的作用，现将结果报道如下。
1 材料和方法
Leptin human L4146(美国Sigma公司)；人RPE细胞株(ARPE-19, 美国ATCC公司)；葡萄糖(南京凯基生物科技发展有限公司)；胰岛素(生物合成人胰岛素注射液；诺和诺德制药有限公司)；Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)/F12培养基，胎牛血清，胰蛋白酶(美国Gibco公司)；鼠抗人8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)单克隆抗体(美国Trevigen公司)；鼠抗人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(hOGG1)单克隆抗体(美国Assay Designs公司)；细胞内氧化应激活性氧(ROS)初级荧光测定试剂盒(上海杰美基因医药有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所)；3-(4, 5-二甲基噻唑2)-2, 5-二苯基四氮唑嗅盐(MTT)(美国Sigma公司)；医用净化工作台(吴江市净化设备总厂)；流式细胞仪(美国FACS Calibur Becton-Dickinson公司)；酶标仪(model 860，BIO-RAD，美国MDC公司)；电泳仪(DYY-5型，北京市六一仪器厂)，正置荧光显微镜(Scope A1，德国Zeiss公司)。
人RPE细胞培养。ARPE-19细胞复苏，细胞融合密度达80%后，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，加入胰酶消化液(0.05%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸)2 ml，倒置相差显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆、细胞间隙变大或少量细胞脱壁漂移时，加入含血清的培养液终止消化，收集细胞悬液，离心半径7.5 cm，1000 r/min离心10 min，将细胞吹打均匀，计数，接种于25 cm2培养瓶中，按1:4至1:6传代，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每周换液2～3次，直至细胞融合。取4～6代80%融合细胞用于实验。
实验分组。将体外培养ARPE-19细胞随机分为成正常对照组、胰岛素抵抗组[4]。正常对照组加入DMEM／F12培养液，胰岛素抵抗组加含30 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰岛素的DMEM／F12培养液。
2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞内ROS水平。正常对照组、胰岛素抵抗组分别加入0、10、100 ng/ml瘦素，干预后24、48、72 h，应用ROS检测试剂盒，按照说明书流程操作。波长488 nm的流式细胞仪计数50 000个细胞，检测平均荧光强度以反映细胞内ROS水平。
免疫细胞化学(ICG)法检测细胞内8-OHdG的表达[5]。以细胞浆呈棕黄色或细胞核、细胞浆同时呈棕黄色为阳性，以细胞核、细胞浆均无着色为阴性。根据阳性细胞着色面积和着色强度积分，应用Image-pro plus图像分析软件进行分析。
蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测hOGG1表达。将各组RPE细胞提取蛋白，BCA法对上清蛋白进行定量。各取出20 μg总蛋白，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印(53 V，60 mA)。封闭过夜。一抗(1:2000鼠抗人hOGG1单克隆抗体)4 ℃过夜。二抗(1:10 000HRP标记的羊抗鼠IgG)室温摇床孵育1 h。电化学发光法显色，凝胶图像分析仪扫描图像。应用Band Scan 5.0图像分析软件读取胶片上各蛋白条带的灰度值，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，以目的蛋白和β-actin条带密度的比值表示目的蛋白的相对含量。
SPSS17.0统计软件包进行统计学分析处理。上述每组实验均重复4次；采用描述性统计分析。计量资料用均数±标准差(
2 结果
DCFH-DA法检测结果显示，干预后24、48、72 h，正常对照组(F=37.136、37.178、49.634)和胰岛素抵抗组(F=9.822、28.881、71.150)RPE细胞ROS表达均随瘦素浓度增加而增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中，胰岛素抵抗组在干预后24 h，RPE细胞ROS的表达量随着瘦素浓度的增加递增，0 ng/ml浓度瘦素干预与10、100 ng/ml浓度瘦素干预之间RPE细胞ROS表达量比较，差异均有统计学意义(F=46.077，P＜0.05)；10 ng/ml浓度瘦素干预与100 ng/ml浓度瘦素干预之间RPE细胞ROS表达量比较，差异无统计学意义(F=6.077，P＞0.05)(图 1)。随干预时间延长，100 ng/ml浓度瘦素干预RPE细胞ROS表达量均升高，差异有统计学意义(F=14.998，P＜0.05)(图 1)。干预后24、48 h，10(F=8.035、7.983)、100 ng/ml浓度瘦素(F=8.063、7.932)正常对照组和胰岛素抵抗组之间RPE细胞ROS表达量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；干预后72 h，胰岛素抵抗组RPE细胞ROS表达量高于正常对照组RPE细胞ROS表达量，差异有统计学意义(F=39.213，P＜0.05)(图 2)。
图1
不同浓度瘦素对人RPE细胞ROS表达的影响。*：与0 ng/ml浓度瘦素比较，P＜0.05
图2
相同浓度瘦素干预下正常组、胰岛素抵抗组RPE细胞ROS表达量。*：与对照组比较，P＜0.05
ICG法检测结果显示，8-OHdG阳性定位于细胞浆和(或)细胞核，呈棕黄色。干预后24、48、72 h，10、100 ng/ml浓度瘦素干预后，正常对照组和胰岛素抵抗组RPE细胞内均有8-OHdG的表达(图 3，4)。
图3
正常对照组RPE细胞ICG染色像。3A~3C.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后24 h；3D~3F.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后48 h；3G~3I.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后72 h。RPE细胞内均有8-OHdG的表达。0、10 ng/ml浓度瘦素ICG ×400，100 ng/ml浓度瘦素ICG ×800 图 4 胰岛素抵抗组RPE细胞ICG染色像。4A~4C.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后24 h；4D~4F.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后48 h；4G~4I.0、10、100 ng/ml浓度瘦素干预后72 h。RPE细胞内均有8-OHdG的表达。0、10 ng/ml浓度瘦素ICG ×400，100 ng/ml浓度瘦素ICG ×800 图 5 不同浓度瘦素对人RPE细胞8-OHdG表达的影响。*:与0 ng/ml浓度比较，P＜0.05 图 6 相同浓度瘦素干预下不同时间点人RPE细胞8-OHdG表达量。*:与干预后24 h比较，P＜0.05 图 7 相同浓度瘦素干预下两组人RPE细胞8-OHdG表达量。*:与对照组比较，P＜0.05 图 8 不同浓度瘦素对人RPE细胞hOGG1表达的影响。*:与0 ng/ml浓度比较，P＜0.05
干预后24、48、72 h，正常对照组(F=88.643、390.920、1039.276)和胰岛素抵抗组(F=273.311、299.155、82.237)RPE细胞8-OHdG的表达随瘦素浓度增加而增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中，正常对照组100 ng/ml浓度瘦素干预后，RPE细胞8-OHdG表达量随干预时间延长而增高，差异均有统计学意义(F=79.823, P＜0.05)(图 5)。胰岛素抵抗组10 ng/ml浓度瘦素干预后72 h的RPE细胞8-OHdG表达量高于干预后24、48 h，差异有统计学意义(F=309.623，P＜0.05)；100 ng/ml浓度瘦素干预后，RPE细胞8-OHdG表达量随干预时间延长有升高趋势，但差异无统计学意义(F=15.389，P＞0.05)(图 6)。10 ng/ml浓度瘦素干预后24、72 h，胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量高于正常对照组，差异有统计学意义(F=157.199、1183.004，P＜0.05)；干预后48 h，正常对照组、胰岛素抵抗组PRE细胞8-OHdG表达量比较，差异无统计学意义(F=9.089，P＞0.05)。100 ng/ml浓度瘦素干预后24、48 h，胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量高于正常对照组，差异有统计学意义(F=52.408、167.983，P＜0.05)(图 7)；干预后72 h，正常对照组、胰岛素抵抗组RPE细胞8-OHdG表达量比较，差异无统计学意义(F=34.527，P＞0.05)。
Western blot检测结果显示，干预后24、48、72 h，正常对照组(F=470.062、1073.113、295.456)、胰岛素抵抗组(F=240.032、592.389、527.760)RPE细胞hOGGl表达量均随瘦素浓度增加递增，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 8, 9)；在相同浓度瘦素干预下，随着时间延长，RPE细胞hOGG1表达量呈现先升高后降低的趋势。干预后48 h，正常对照组(F=83.673、268.000、373.492)、胰岛素抵抗组(F=49.021、304.293、294.293)RPE细胞hOGGl表达量均高于干预后24、72hRPE细胞hOGGl表达量，差异有统计学意义(P＜0.05)。
图9
Western blot图。9A.正常对照组。9B.胰岛素抵抗组。1~3：0、10、100 ng/ml。不同浓度瘦素干预下RPE细胞内hOGGl的表达量
10 ng/ml浓度瘦素干预后24 h，胰岛素抵抗组、正常对照组RPE细胞hOGGl表达量比较，差异无统计学意义(F=23.392，P＞0.05)；干预后48、72 h，胰岛素抵抗组RPE细胞hOGGl表达量低于正常对照组，差异有统计学意义(F=293.392、129.394，P＜0.05)。100 ng/ml浓度瘦素干预24 h，胰岛素抵抗组、正常对照组RPE细胞hOGGl表达量比较，差异无统计学意义(F=9.023，P＞0.05)；干预后48 h，正常对照组RPE细胞hOGGl表达量低于胰岛素抵抗组，差异有统计学意义(F=593.02，P＜0.05)；干预后72 h，胰岛素抵抗组RPE细胞hOGGl表达量低于正常对照组，差异有统计学意义(F=329.89，P＜0.05)。
3 讨论
有临床研究发现，胰岛素抵抗患者的DR发生高于无胰岛素抵抗患者，但是否与脂肪因子的分泌有关目前尚不清楚[6]。瘦素是一种脂肪因子，免疫组织化学研究发现，在糖尿病患者的视网膜外纤维血管组织的视网膜前膜组织中检测出了瘦素效应受体长型受体中存在着瘦素和瘦素受体，在增生型DR(PDR)患者的表达[7]，而对正常人的视网膜组织进行相同的检测却并未检测到它的表达。同时还有研究发现，在PDR患者的玻璃体液中瘦素浓度显著高于正常人，既使把体重指数对瘦素水平的影响去除后结果也如此。体外实验已证明，瘦素在PDR患者玻璃体液中的平均浓度已能够有效地促进新生血管的形成[8]。这些均提示瘦素是促进PDR的发生发展的直接因素之一。瘦素在DR的发生发展过程中究竟如何发挥作用？这是本研究想要探讨的问题。统一机制学说认为氧化应激是DR发生发展过程中的重要因素[6]，RPE细胞因分泌内源性抗新生血管因子色素上皮衍生因子而在抗新生血管生成中发挥着重要作用，因此我们选择了RPE细胞做为研究对象，模拟胰岛素抵抗环境，观察瘦素对RPE细胞氧化损伤的影响。
ROS被认为是引起DNA氧化损伤的主要因素之一，而ROS可使鸟嘌呤(G)氧化为8-OHdG，在体内形成后较为稳定、易于检测，被视为DNA氧化损伤的生物标志物。本研究结果显示，无论在正常状态还是胰岛素抵抗状态下，RPE细胞内ROS、8-OHdG的表达量均随着瘦素浓度增加而增加，差异具有统计学意义；而在相同瘦素浓度的干预下，两组RPE细胞内ROS、8-OHdG的表达量呈现胰岛素抵抗组高于正常对照组的趋势，虽然在干预后24、48 h时两组RPE细胞内ROS的表达的差异不具有统计学意义，仍提示无论是正常状态还是胰岛素抵抗状态下，瘦素均能诱发人RPE细胞的氧化损伤，而在胰岛素抵抗状态下，瘦素诱发的人RPE细胞的氧化损伤程度更重。
正常细胞具有多种应对氧化损伤的机制，哺乳动物中负责DNA链8-OHdG突变修复的主要DNA糖基化酶之一是8-羟基鸟嘌呤糖基化酶(OGG)，人类的称为hOGG[9]。本研究结果显示，两组RPE细胞内hOGGl的表达量均随瘦素浓度的增加递增，差异有统计学意义；在相同浓度瘦素干预下，两组RPE细胞内hOGGl的表达均显示干预后48 h时高于干预后24、72 h时。因此我们推测，瘦素在诱发RPE细胞氧化损伤的同时，启动了氧化损伤的代偿性修复，但随着时间的延长及氧化损伤程度的加重，氧化损伤的修复能力下降。另外，我们还发现以10 ng/ml浓度瘦素干预的两组RPE细胞内hOGG1表达量呈现胰岛素抵抗组低于正常对照组的趋势；而以100 ng/ml浓度瘦素干预的两组RPE细胞内hOGG1表达量干预后48 h时正常对照组低于胰岛素抵抗组，差异有统计学意义；干预后72 h时胰岛素抵抗组低于正常对照组，差异有统计学意义；提示针对瘦素引起的氧化损伤，胰岛素抵抗状态下的RPE细胞更易发挥代偿性氧化损伤修复的作用，但随着氧化损伤的加重，胰岛素抵抗状态下的RPE细胞更易发生氧化损伤修复失代偿。
由于并未观察瘦素是否对与DR发生直接相关的视网膜血管内皮细胞或周细胞产生氧化损伤，本研究结果对探讨瘦素在DR发生发展中的作用尚有局限性。
