本文旨在通过对去细胞化天然材料进行肝素化修饰, 改善其作为组织工程支架材料的抗凝血性能。本文以猪肝去细胞化材料为研究对象, 对材料分别进行了层层自组装(LBL)肝素化修饰、多点连接(MPA)肝素化修饰或末端连接(EPA)肝素化修饰, 然后检测它们的肝素化效果及抗凝血性能。结果表明, 三种肝素化修饰材料的抗凝血性能与未经处理的去细胞化材料相比均有显著提高, 其中EPA修饰肝素化材料的凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)均超过检测仪器最大值。同时, EPA修饰肝素化去细胞化材料修饰时间最短, 肝素释放最慢, 复钙时间最长。本研究结果显示EPA肝素化修饰的去细胞化材料获得了良好的抗凝血性能。
引用本文： 包骥, 孙赳, 周永杰, 吴琼, 王宇嘉, 李丽, 姜鑫, 马朗, 谢明均, 石毓君, 步宏. 去细胞化支架材料肝素化修饰及抗凝性能研究. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(3): 594-598. doi: 10.7507/1001-5515.20150108 复制
引言
去细胞化生物材料作为组织工程支架材料，已被广泛应用于基础研究和临床治疗。它具有良好的生物相容性和组织三维结构，解决了细胞植入位点和血液供应两大难题，是理想的组织工程支架材料。猪肝脏容易获取，大小与人肝接近，是构建具有临床应用前景的组织工程肝脏最佳的去细胞化支架来源。但是，猪肝比以往组织工程技术报道的心瓣膜[1]、心包补片[2]、血管[3]、神经支架[4]、膀胱等材料具有更复杂的结构，接收双重血供，有丰富的肝血窦，而且整个器官与血液接触紧密，更易因胶原暴露激活内源性凝血途径而产生血液凝固。为解决去细胞化材料植入体内的血液相容性问题，本文以猪肝去细胞材料为例，对其进行肝素抗凝修饰的研究，希望改善材料的血液相容性，以便将其运用到更广泛的组织工程领域。
1 材料与方法
1.1 动物、主要试剂及仪器设备
实验用巴马香猪由四川大学华西医院实验动物中心提供，3月龄，体重15 kg。肝素钠(成都市科龙化工试剂厂)，1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimidehydro-chloride, EDC, TOSHIMA公司)，聚二甲基二烯丙基氯化铵(polyelectrolyte polydiallydimethylammonium chloride, PDADMAC, SIGEMA-ALDRIH公司)，氰基硼氢化钠(NaBH3CN, 成都市科龙化工试剂厂)。酶标仪(BIOTEK, 美国)，CA-50半自动血凝仪(SYSMEX, 日本)。
1.2 去细胞化猪肝材料的制备
氯胺酮肌注麻醉后，备皮，消毒铺巾，逐层开腹进入腹腔，仔细解剖肝十二指肠韧带，分离门静脉并带线。结扎并离断肝胃韧带、肝动脉、胆总管。结扎门静脉远端，在近端剪开一小口置入硅胶导管并固定，立即行0.1%乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA)液体灌注，同时离断肝周韧带，取出肝脏，置于无菌容器内继续灌注，至肝脏内血液完全流尽，-20℃保存。肝脏在4℃解冻后，用1%十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulphate, SDS)溶液以200 mL/min流速灌注9 h，之后1% Triton X-100溶液和去离子水灌洗去除残留SDS，获得去细胞化猪肝脏材料。将去细胞化猪肝材料制成厚度为300μm、直径为1 cm的样本，放入24孔板中，冻干后射线灭菌备用。本实验所用去细胞化肝脏材料来自同一头猪。根据肝素化修饰方式的不同，实验组材料分为三组：层层自组装修饰(layer-by-layer self-assembly, LBL)组、多点连接修饰(multi-point attachment, MPA)组和末端连接修饰(end-point attachment, EPA)组。对照组材料为未经肝素化修饰的去细胞化猪肝材料。
1.3 去细胞化猪肝材料肝素化修饰
1.3.1 LBL修饰
按照本组之前报道的LBL方法[5]。用无菌双蒸水配制成1 g/L的PDADMAC溶液和2 g/L的肝素钠溶液。将装有材料的24孔板放置于定轨摇床上，每孔加入PDADMAC溶液1 mL，置于摇床摇动10 min后，静置20 min。吸除PDADMAC溶液，加入无菌蒸馏水1 mL摇动洗涤10 min。吸除蒸馏水后加入肝素钠溶液1 mL，摇动10 min，静置20 min。吸除肝素钠溶液，加入无菌蒸馏水，摇动洗涤10 min，吸除蒸馏水。重复上述步骤8次，最后吸尽孔板内液体，去离子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.3.2 MPA修饰
根据Wang等[6]报道的肝素化修饰方法。将装有材料的24孔板放置于定轨摇床上，加入1 mol/L的硫酸羟胺盐37℃摇动孵育12 h。吸除硫酸羟胺盐溶液，用去离子化水漂洗3次，加入肝素钠-EDC溶液(1.67 g EDC，0.835 g肝素钠，0.05 mol/L盐酸200 mL，调pH至1.5)，摇动48 h。吸除肝素钠-EDC溶液，去离子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.3.3 EPA修饰
改进Tsai等[7]报道的肝素化修饰方法。用0℃去离子水配制300 mL浓度为3.3 g/L肝素钠溶液，加入10 mg亚硝酸钠，用1 mol/L盐酸调节pH 2.7，搅拌2 h使肝素钠解聚。用1 mol/L NaOH调节pH至7.0。聚肝素钠溶液中加入氰基硼氢化钠(10 mg/L)及NaCl(0.15 mol/L)，用1 mol/L盐酸调节pH至3.5。向装有材料的24孔板中每孔加入1 mL上述溶液，37℃静置2 h。吸除溶液，去离子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.4 甲苯胺蓝染色
将实验组和对照组材料每组各取3个样本，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，用50 mg/L甲苯胺蓝(toluidine blue, TB)水溶液染色15 min，Olympus光学显微镜下观察拍照，定性检测支架材料中肝素固定情况，有肝素固定区域染色呈蓝色。
1.5 肝素钠含量测定
将实验组材料每组各取6个样本，剪碎后分别放入1.5 mL微量冷冻管。向管中加入80μL TL缓冲液，再加入OB蛋白酶8μL，充分涡旋搅拌。将冷冻管放入55℃水浴锅中孵育3 h。每20~30 min涡旋搅拌一次。1 000×g离心5 min。吸取上清液，根据刘秀英等[8]提出的方法测量肝素含量。
1.6 肝素释放速率测定
参照Lu等[9]检测肝素释放速度方法，向装有实验组材料的24孔培养板每孔加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)2.5 mL，室温下浸泡制备浸提液。在不同的浸泡时间取样，用TB法检测浸提液中的游离肝素量，除以材料中的肝素含量，即可计算肝素分子的释放速率。
1.7 凝血时间检测
按照Lv等[10]和Ran等[11]材料体外凝血时间检测方法，取实验组和对照组材料，每组6个平行样，与健康人血浆在37℃孵育30 min后，血浆转入凝血检测专用透明硅化玻管，置入CA-50半自动血凝仪，按说明书使用相应试剂盒测定凝血酶时间(thrombin time, TT)、凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)。
1.8 复钙时间测定
根据李沁华等[12]复钙时间的检测方法，实验组和对照组每组材料6个平行样，向装有实验组和对照组材料的24孔培养板的每孔中加入0.5 mL抗凝血浆和0.025 mol/L CaCl2溶液0.2 mL，于37℃恒温水浴，秒表计时，当孔板内出现一丝纤状物时停表，得到复钙时间。
1.9 数据处理
数据用均值±标准差(
2 结果
2.1 TB染色
与对照组材料相比，实验组材料均沿胶原基质表面蓝染，内部区域呈淡染，EPA组材料胶原基质内部蓝色较另两组更深，如图 1所示，表明实验组材料上均成功固定有肝素。
图1
三种肝素化修饰支架材料TB染色
Figure1.
TB staining of three kinds of heparin modified scaffolds
2.2 肝素含量
为了使后续抗凝性能研究数据具有可比性，通过对肝素化修饰条件的控制，使三种方法得到的肝素化修饰支架材料中肝素含量相近，LBL组为(24.81±0.12)μg/cm2，MPA组为(24.76±0.14)μg/cm2，EPA组为(25.03±0.15)μg/cm2，三组之间差异没有统计学意义(P值均＞0.05)。
2.3 肝素释放速率
如图 2所示，实验组各组材料前2 h肝素基本未释放，在2~6 h迅速释放，且LBL组释放最快，EPA组释放最慢，之后释放速率逐渐减慢，趋于平稳。第168 h时三者释放速率接近。EPA组释放曲线最低，168 h后肝素剩余量最多(35.4%)；LBL组与MPA组曲线接近，168 h后肝素剩余量均为15%左右。
图2
不同时间点支架材料的肝素累计释放百分比
Figure2.
Heparin relative release percent of scaffolds in different time points
2.4 凝血指标
实验组材料TT、PT、APTT值与对照组相比均有显著增加(P＜0.05)，其中EPA组材料TT、PT、APTT值均超过设备测量值上限，如图 3所示。结果表明，EPA组材料具有更好的抗凝性能。
图3
各组材料的凝血指标
与对照组相比, *
Compared with the control group, *
2.5 复钙时间
复钙时间测定是在已除去Ca2+的血浆中重新加入Ca2+，测定血液出现凝固的时间即复钙时间，其意义在于检测内源凝血系统[13]。一般来讲，复钙时间越长，抗凝血性能越好。经测定实验组材料的复钙时间分别为：LBL组(236.1±15.5)s，MPA组(214±21.6)s，EPA组(312±28.5)s。三个实验组材料复钙时间均显著长于对照组[(108.5±10.3)s](P＜0.001)，约为对照组材料复钙时间的2倍，其中EPA组复钙时间最长。
3 讨论
去细胞化材料中含有大量暴露的胶原蛋白纤维，而胶原纤维暴露是血栓发生过程中的主要事件[14]。凝血过程包含一系列酶原的激活，最终将无活性的凝血酶原转化为有活性的凝血酶，将可溶性的纤维蛋白转化为不溶性的纤维蛋白从而引起血液凝固。而抗凝血酶Ⅲ是天然的抗血栓剂，是凝血过程的丝氨酸蛋白酶的抑制剂，并被认为是凝血酶的“自杀型”抑制剂[15]。肝素是带负电的线形多聚糖，由两个重复的双糖单位(L-艾杜糖酸D-葡糖胺和D型乙酰葡糖胺)构成[16]。由于肝素独特的结构，它可以与抗凝血酶Ⅲ形成复合物，从而结合活化的凝血因子，起到消除这些凝血因子的作用[17]。同大多数丝氨蛋白酶与抑制剂的反应相比，抗凝血酶Ⅲ与凝血酶的反应速度较慢，但在肝素存在的情况下，反应速度可增加几千倍，能有效地抑制凝血过程，因此肝素被广泛用作抗凝药物[17]。在去细胞化材料表面进行肝素修饰，成为解决材料血液相容性问题的一种常用措施。
本文中，实验组材料TB染色均为阳性，而对照组材料为阴性。EPA组的TB染色最深，而且蓝色区域并非局限于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)边缘，而是深入ECM内部。MPA组和EPA组材料中的肝素共价结合于ECM[14]，而LBL组材料中肝素靠静电吸引结合于ECM上[5]，前一种方式结合力更强，肝素结合较为牢固，释放较为缓慢。进一步比较EPA组与MPA组材料，EPA组材料解聚后的肝素分子量更小[7]，更容易深入ECM内部，因而释放更加缓慢。本组结果显示EPA组材料的血液相容性获得了最为显著和稳定的改善。
在TT、PT和APTT测试过程中，去细胞化材料首先与富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)中纤维蛋白原等血浆蛋白接触，此时材料表面吸附的血浆蛋白数量和牢固程度将直接影响随后血液—材料间的相互作用，对测量结果产生影响。在EPA组材料中，肝素分子呈纤毛状末端共价固定在ECM表面[7]，这样纤维蛋白原首先吸附在了纤毛状的肝素分子上，而非ECM表面，纤毛的摆动性使吸附上的纤维蛋白原很容易在后续的洗涤过程中被洗脱掉。因此，EPA组材料的TT、PT和APTT测量值都超出了机器检测上限，同时，复钙时间也最长，在体外实验中表现出了优异的抗凝血性能。
在本研究中，我们探讨了三种温和反应条件下对去细胞化材料的肝素修饰方式。与对照组相比，实验组材料的血液相容性均获得了显著改善，特别是EPA组材料的血液相容性各项指标都明显优于其他两种修饰方法。通过肝素化修饰改善可植入去细胞化材料的血液相容性，是一项重大的技术改进，具有广阔的应用前景。当然，目前研究尚处于体外研究阶段，该技术的安全性和有效性还有待体内实验的进一步检验。
引言
去细胞化生物材料作为组织工程支架材料，已被广泛应用于基础研究和临床治疗。它具有良好的生物相容性和组织三维结构，解决了细胞植入位点和血液供应两大难题，是理想的组织工程支架材料。猪肝脏容易获取，大小与人肝接近，是构建具有临床应用前景的组织工程肝脏最佳的去细胞化支架来源。但是，猪肝比以往组织工程技术报道的心瓣膜[1]、心包补片[2]、血管[3]、神经支架[4]、膀胱等材料具有更复杂的结构，接收双重血供，有丰富的肝血窦，而且整个器官与血液接触紧密，更易因胶原暴露激活内源性凝血途径而产生血液凝固。为解决去细胞化材料植入体内的血液相容性问题，本文以猪肝去细胞材料为例，对其进行肝素抗凝修饰的研究，希望改善材料的血液相容性，以便将其运用到更广泛的组织工程领域。
1 材料与方法
1.1 动物、主要试剂及仪器设备
实验用巴马香猪由四川大学华西医院实验动物中心提供，3月龄，体重15 kg。肝素钠(成都市科龙化工试剂厂)，1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimidehydro-chloride, EDC, TOSHIMA公司)，聚二甲基二烯丙基氯化铵(polyelectrolyte polydiallydimethylammonium chloride, PDADMAC, SIGEMA-ALDRIH公司)，氰基硼氢化钠(NaBH3CN, 成都市科龙化工试剂厂)。酶标仪(BIOTEK, 美国)，CA-50半自动血凝仪(SYSMEX, 日本)。
1.2 去细胞化猪肝材料的制备
氯胺酮肌注麻醉后，备皮，消毒铺巾，逐层开腹进入腹腔，仔细解剖肝十二指肠韧带，分离门静脉并带线。结扎并离断肝胃韧带、肝动脉、胆总管。结扎门静脉远端，在近端剪开一小口置入硅胶导管并固定，立即行0.1%乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA)液体灌注，同时离断肝周韧带，取出肝脏，置于无菌容器内继续灌注，至肝脏内血液完全流尽，-20℃保存。肝脏在4℃解冻后，用1%十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulphate, SDS)溶液以200 mL/min流速灌注9 h，之后1% Triton X-100溶液和去离子水灌洗去除残留SDS，获得去细胞化猪肝脏材料。将去细胞化猪肝材料制成厚度为300μm、直径为1 cm的样本，放入24孔板中，冻干后射线灭菌备用。本实验所用去细胞化肝脏材料来自同一头猪。根据肝素化修饰方式的不同，实验组材料分为三组：层层自组装修饰(layer-by-layer self-assembly, LBL)组、多点连接修饰(multi-point attachment, MPA)组和末端连接修饰(end-point attachment, EPA)组。对照组材料为未经肝素化修饰的去细胞化猪肝材料。
1.3 去细胞化猪肝材料肝素化修饰
1.3.1 LBL修饰
按照本组之前报道的LBL方法[5]。用无菌双蒸水配制成1 g/L的PDADMAC溶液和2 g/L的肝素钠溶液。将装有材料的24孔板放置于定轨摇床上，每孔加入PDADMAC溶液1 mL，置于摇床摇动10 min后，静置20 min。吸除PDADMAC溶液，加入无菌蒸馏水1 mL摇动洗涤10 min。吸除蒸馏水后加入肝素钠溶液1 mL，摇动10 min，静置20 min。吸除肝素钠溶液，加入无菌蒸馏水，摇动洗涤10 min，吸除蒸馏水。重复上述步骤8次，最后吸尽孔板内液体，去离子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.3.2 MPA修饰
根据Wang等[6]报道的肝素化修饰方法。将装有材料的24孔板放置于定轨摇床上，加入1 mol/L的硫酸羟胺盐37℃摇动孵育12 h。吸除硫酸羟胺盐溶液，用去离子化水漂洗3次，加入肝素钠-EDC溶液(1.67 g EDC，0.835 g肝素钠，0.05 mol/L盐酸200 mL，调pH至1.5)，摇动48 h。吸除肝素钠-EDC溶液，去离子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.3.3 EPA修饰
改进Tsai等[7]报道的肝素化修饰方法。用0℃去离子水配制300 mL浓度为3.3 g/L肝素钠溶液，加入10 mg亚硝酸钠，用1 mol/L盐酸调节pH 2.7，搅拌2 h使肝素钠解聚。用1 mol/L NaOH调节pH至7.0。聚肝素钠溶液中加入氰基硼氢化钠(10 mg/L)及NaCl(0.15 mol/L)，用1 mol/L盐酸调节pH至3.5。向装有材料的24孔板中每孔加入1 mL上述溶液，37℃静置2 h。吸除溶液，去离子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.4 甲苯胺蓝染色
将实验组和对照组材料每组各取3个样本，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，用50 mg/L甲苯胺蓝(toluidine blue, TB)水溶液染色15 min，Olympus光学显微镜下观察拍照，定性检测支架材料中肝素固定情况，有肝素固定区域染色呈蓝色。
1.5 肝素钠含量测定
将实验组材料每组各取6个样本，剪碎后分别放入1.5 mL微量冷冻管。向管中加入80μL TL缓冲液，再加入OB蛋白酶8μL，充分涡旋搅拌。将冷冻管放入55℃水浴锅中孵育3 h。每20~30 min涡旋搅拌一次。1 000×g离心5 min。吸取上清液，根据刘秀英等[8]提出的方法测量肝素含量。
1.6 肝素释放速率测定
参照Lu等[9]检测肝素释放速度方法，向装有实验组材料的24孔培养板每孔加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)2.5 mL，室温下浸泡制备浸提液。在不同的浸泡时间取样，用TB法检测浸提液中的游离肝素量，除以材料中的肝素含量，即可计算肝素分子的释放速率。
1.7 凝血时间检测
按照Lv等[10]和Ran等[11]材料体外凝血时间检测方法，取实验组和对照组材料，每组6个平行样，与健康人血浆在37℃孵育30 min后，血浆转入凝血检测专用透明硅化玻管，置入CA-50半自动血凝仪，按说明书使用相应试剂盒测定凝血酶时间(thrombin time, TT)、凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)。
1.8 复钙时间测定
根据李沁华等[12]复钙时间的检测方法，实验组和对照组每组材料6个平行样，向装有实验组和对照组材料的24孔培养板的每孔中加入0.5 mL抗凝血浆和0.025 mol/L CaCl2溶液0.2 mL，于37℃恒温水浴，秒表计时，当孔板内出现一丝纤状物时停表，得到复钙时间。
1.9 数据处理
数据用均值±标准差(
2 结果
2.1 TB染色
与对照组材料相比，实验组材料均沿胶原基质表面蓝染，内部区域呈淡染，EPA组材料胶原基质内部蓝色较另两组更深，如图 1所示，表明实验组材料上均成功固定有肝素。
图1
三种肝素化修饰支架材料TB染色
Figure1.
TB staining of three kinds of heparin modified scaffolds
2.2 肝素含量
为了使后续抗凝性能研究数据具有可比性，通过对肝素化修饰条件的控制，使三种方法得到的肝素化修饰支架材料中肝素含量相近，LBL组为(24.81±0.12)μg/cm2，MPA组为(24.76±0.14)μg/cm2，EPA组为(25.03±0.15)μg/cm2，三组之间差异没有统计学意义(P值均＞0.05)。
2.3 肝素释放速率
如图 2所示，实验组各组材料前2 h肝素基本未释放，在2~6 h迅速释放，且LBL组释放最快，EPA组释放最慢，之后释放速率逐渐减慢，趋于平稳。第168 h时三者释放速率接近。EPA组释放曲线最低，168 h后肝素剩余量最多(35.4%)；LBL组与MPA组曲线接近，168 h后肝素剩余量均为15%左右。
图2
不同时间点支架材料的肝素累计释放百分比
Figure2.
Heparin relative release percent of scaffolds in different time points
2.4 凝血指标
实验组材料TT、PT、APTT值与对照组相比均有显著增加(P＜0.05)，其中EPA组材料TT、PT、APTT值均超过设备测量值上限，如图 3所示。结果表明，EPA组材料具有更好的抗凝性能。
图3
各组材料的凝血指标
与对照组相比, *
Compared with the control group, *
2.5 复钙时间
复钙时间测定是在已除去Ca2+的血浆中重新加入Ca2+，测定血液出现凝固的时间即复钙时间，其意义在于检测内源凝血系统[13]。一般来讲，复钙时间越长，抗凝血性能越好。经测定实验组材料的复钙时间分别为：LBL组(236.1±15.5)s，MPA组(214±21.6)s，EPA组(312±28.5)s。三个实验组材料复钙时间均显著长于对照组[(108.5±10.3)s](P＜0.001)，约为对照组材料复钙时间的2倍，其中EPA组复钙时间最长。
3 讨论
去细胞化材料中含有大量暴露的胶原蛋白纤维，而胶原纤维暴露是血栓发生过程中的主要事件[14]。凝血过程包含一系列酶原的激活，最终将无活性的凝血酶原转化为有活性的凝血酶，将可溶性的纤维蛋白转化为不溶性的纤维蛋白从而引起血液凝固。而抗凝血酶Ⅲ是天然的抗血栓剂，是凝血过程的丝氨酸蛋白酶的抑制剂，并被认为是凝血酶的“自杀型”抑制剂[15]。肝素是带负电的线形多聚糖，由两个重复的双糖单位(L-艾杜糖酸D-葡糖胺和D型乙酰葡糖胺)构成[16]。由于肝素独特的结构，它可以与抗凝血酶Ⅲ形成复合物，从而结合活化的凝血因子，起到消除这些凝血因子的作用[17]。同大多数丝氨蛋白酶与抑制剂的反应相比，抗凝血酶Ⅲ与凝血酶的反应速度较慢，但在肝素存在的情况下，反应速度可增加几千倍，能有效地抑制凝血过程，因此肝素被广泛用作抗凝药物[17]。在去细胞化材料表面进行肝素修饰，成为解决材料血液相容性问题的一种常用措施。
本文中，实验组材料TB染色均为阳性，而对照组材料为阴性。EPA组的TB染色最深，而且蓝色区域并非局限于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)边缘，而是深入ECM内部。MPA组和EPA组材料中的肝素共价结合于ECM[14]，而LBL组材料中肝素靠静电吸引结合于ECM上[5]，前一种方式结合力更强，肝素结合较为牢固，释放较为缓慢。进一步比较EPA组与MPA组材料，EPA组材料解聚后的肝素分子量更小[7]，更容易深入ECM内部，因而释放更加缓慢。本组结果显示EPA组材料的血液相容性获得了最为显著和稳定的改善。
在TT、PT和APTT测试过程中，去细胞化材料首先与富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)中纤维蛋白原等血浆蛋白接触，此时材料表面吸附的血浆蛋白数量和牢固程度将直接影响随后血液—材料间的相互作用，对测量结果产生影响。在EPA组材料中，肝素分子呈纤毛状末端共价固定在ECM表面[7]，这样纤维蛋白原首先吸附在了纤毛状的肝素分子上，而非ECM表面，纤毛的摆动性使吸附上的纤维蛋白原很容易在后续的洗涤过程中被洗脱掉。因此，EPA组材料的TT、PT和APTT测量值都超出了机器检测上限，同时，复钙时间也最长，在体外实验中表现出了优异的抗凝血性能。
在本研究中，我们探讨了三种温和反应条件下对去细胞化材料的肝素修饰方式。与对照组相比，实验组材料的血液相容性均获得了显著改善，特别是EPA组材料的血液相容性各项指标都明显优于其他两种修饰方法。通过肝素化修饰改善可植入去细胞化材料的血液相容性，是一项重大的技术改进，具有广阔的应用前景。当然，目前研究尚处于体外研究阶段，该技术的安全性和有效性还有待体内实验的进一步检验。
