含铜胺氧化酶1（AOC1）是含铜胺氧化酶家族中的关键成员，催化组胺和腐胺的脱氨氧化反应。近年来，AOC1被发现与多种癌症相关，它在某些癌细胞中的表达水平显著升高，提示可能在癌症进展中起到重要作用。然而，AOC1在脂代谢中的功能仍未被充分研究。通过遗传学分析，我们发现AOC1与脂代谢存在潜在关联。接着，我们构建了Aoc1−/−小鼠模型，并在标准饮食和高脂饮食条件下对其代谢表型进行了研究。实验结果显示，在高脂饮食条件下，Aoc1−/−小鼠表现出体脂含量增加和葡萄糖耐受不良，白色脂肪组织和肝脏中的脂质积累显著增加。本研究揭示了AOC1在脂代谢中的潜在作用，以及它在代谢紊乱如肥胖和2型糖尿病中的潜在功能，为代谢性疾病的治疗提供了新的靶点和研究方向。
引用本文： 向思婷, 刘莘颖, 李匡政, 赵同金, 王旭. 含铜胺氧化酶1在脂代谢中的功能研究. 生物医学工程学杂志, 2024, 41(5): 1019-1025, 1034. doi: 10.7507/1001-5515.202407066 复制
0 引言
含铜胺氧化酶是一类可以催化生物胺脱氨氧化，生成相应的醛，并将氧气还原为过氧化氢的酶[1]。哺乳动物含铜胺氧化酶家族主要由AOC1、AOC2、AOC3和AOC4构成。AOC1编码二胺氧化酶，AOC2和AOC3编码氨基脲敏感性胺氧化酶（semicarbazide-sensitive amine oxidase，SSAO），AOC4仅在某些动物中完整表达[2]。
AOC1又被称为二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO），绝大部分被储存于细胞内，在刺激下会被释放到局部，仅小部分会出现在外周循环中，半衰期约为1 h[2]。AOC1的主要底物为组胺和腐胺，在人的肠道、肾脏等组胺/腐胺摄取和排泄部位的表达丰度最高[3]。AOC1是胞外降解组胺的必需酶，组胺不耐受患者常表现出血清AOC1降低的表型[4]。AOC1还被报道与癌症密切相关，癌细胞中AOC1的升高会促进肿瘤增殖、侵袭和迁移，下调AOC1可以抑制肿瘤生长[5-6]。AOC1催化的酶促反应受到多种因素的调控，包括铜、pH值、底物浓度和抑制剂等。铜是AOC1的必需辅因子，直接参与电子转移过程，促进底物的氧化，铜离子的缺乏会显著降低AOC1的活性[7]。
目前尚无AOC1在脂质代谢调节过程中发挥作用的相关报道。为了探究AOC1是否存在其他未知的功能，我们利用T2DKP数据库[8]对AOC1进行了遗传学分析，构建Aoc1全身敲除小鼠（Aoc1−/−），并在标准饮食与高脂饮食饲养条件下鉴定其代谢表型，探讨了AOC1在机体脂质代谢中的功能，为相关疾病的治疗与新药研发提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
实验动物选用雄性C57BL/6小鼠和Aoc1−/−小鼠，体重（20±1）g。Aoc1+/−小鼠（株NO.T027589）购自集萃药康（中国南京）。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2019-0002；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0032。高脂饮食组小鼠8对，标准饮食组小鼠6对。高脂饲料购自美国Research Diets公司，货号D12492。标准饲料购自南京协同，货号1010084。
1.1.2 主要试剂及配方
试剂：蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂I、磷酸酶抑制剂II购自美国MCE公司；EDTA、NaCl购自上海生工公司；HEPES-Na、SDS购自美国Sigma公司；Na2HPO4、KH2PO4、KCl购自国药沪试公司；Tween-20购自美国Thermo公司；氯仿、甲醇购自国药集团；Wako LabAssayTM试剂盒购自富士胶片和光（广州）贸易有限公司；AOC1抗体购自美国Proteintech公司，16338-1-AP；GAPDH抗体购自美国Proteintech公司，60004-1-Ig。
配方：Buffer B（2 mmol/L EDTA，100 mmol/L HEPES-Na，2.5% SDS）；PBST（8 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L KCl，140 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.4）。
1.1.3 主要仪器
电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，ME2002E）、核磁共振分析仪（美国Bruker公司，minispec LF50）、血糖仪和血糖试纸（美国拜尔公司，Contour plus）、小动物能量检测系统（美国Columbus公司，CLAMS-16M）、微量分光光度计(美国Thermo公司，WI53711)、多模块实时荧光定量PCR系统（美国Thermo公司，QuantStudio 7）、多用途金属浴（杭州奥盛公司，MiniT-H2C）、
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠体重与体成分数据收集
每周称量一次体重，每两周检测一次体成分。使用核磁共振分析仪进行小鼠身体组分测定，测定之前实验动物不需要麻醉和特殊准备。每两周周五的固定时间点测量体成分。
1.2.2 口服葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验
在口服葡萄糖耐受实验（oral glucose tolerance test，OGTT）中，将小鼠禁食16 h，上午9点测定小鼠体重和空腹血糖，根据体重灌胃葡萄糖（标准饮食小鼠灌胃2 g/kg葡萄糖，高脂饮食小鼠灌胃1 g/kg葡萄糖），在15、30、60、90、120 min测定小鼠血糖并记录。在胰岛素耐受实验（insulin tolerance test，ITT）中，将小鼠禁食6 h，下午2点测定小鼠体重和空腹血糖，然后腹腔注射胰岛素（标准饮食小鼠注射剂量为0.5 U/kg，高脂饮食小鼠注射剂量为1 U/kg），在15、30、60、90、120 min测定小鼠血糖并记录。
1.2.3 小肠上皮细胞的蛋白免疫印记法（western blot）
解剖小鼠，将粘连在十二指肠周围的胰腺剔除干净，分离十二指肠、空肠和回肠。将分离的肠道纵向剖开，在PBS缓冲液中清洗后，用盖玻片将小肠上皮细胞刮下，并转移至EP管内，液氮速冻保存。使用时，加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂I和磷酸酶抑制剂II的Buffer B研磨组织，并进行BCA定量，根据定量结果取适量匀浆液加入对应体积的5×SDS，95 ℃金属浴加热10 min后即可上样。SDS-PAGE电泳结束后，将分离好的蛋白转到PVDF膜上，4 ℃过夜孵育一抗，所用抗体为AOC1和GAPDH。次日上午，用PBST洗膜三次，二抗室温孵育1 h，使用ECL试剂盒进行显影。
1.2.4 肝脏脂质含量测定
取0.1 g左右的肝脏组织，在4 mL氯仿甲醇（2∶1）混合溶剂中研磨至无明显组织块。研磨完成后，加入800 μL生理盐水，混匀后在4 ℃、1 000 r/min条件下离心20 min。将下层有机相移动至5 mL玻璃容量瓶中，加入足量氯仿调整相分界线，使分界线靠近刻度线（略低），次日使用氯仿定容。在2 mL的圆底深孔板中，加入10 μL的Triton X-100与氯仿（2∶1）混合溶剂，根据Wako LabAssayTM试剂盒指导，逐一添加标准液以及20 μL的样品溶液至相应的孔中，混匀后将深孔板放入干燥箱中过夜。次日，每孔加入300 μL的Wako LabAssayTM显色剂，于37 ℃孵育箱中孵育。将样品转移至96孔酶标板中。在600 nm波长处测量吸光度，以确定样品中甘油三酯的浓度。
1.2.5 代谢笼分析
使用小动物能量检测系统进行代谢笼分析，检测笼温度为22 ℃，光周期为12 h明/12 h暗。实验前一周将小鼠单独饲养，并适应代谢笼环境2天，随后对小鼠进行为期2天的代谢笼监测。
1.2.6 统计学分析方法
所有数据均使用SPSS 25.0软件进行统计分析，结果以均值±标准差表示，并使用OriginLab作图。组间比较采用学生t检验，检验水准为0.05。
2 结果
2.1 AOC1与代谢疾病强相关
为了寻找AOC1与代谢性疾病的潜在关联，我们利用T2DKP数据库对AOC1基因进行了遗传学分析。如图1a所示，通过基因与表型关联分析（关联性非常强：HuGE≥30[9]），我们发现AOC1与多种代谢指标，如体重、载脂蛋白a、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯等存在显著关联，这表明AOC1可能在代谢调节中起关键作用。如图1b所示，遗传变异分析显示，AOC1基因区域内存在多个与脂代谢相关的变异，可能会影响体重、体重指数（body mass index，BMI）、舒张压、血清白蛋白和高密度脂蛋白胆固醇等代谢指标（此处仅展示关联性较强的表型，完整数据参见附件1）。此结果表明AOC1可能在脂质代谢中发挥重要作用。
图1
AOC1与人类疾病关联性的综合分析结果
a：HuGE评分；b：
a. HuGE score; b. phenotypes that may be affected by variations within the
2.2 构建并验证Aoc1−/−小鼠
首先，我们在野生型小鼠（Aoc1+/+）的全身组织中检测了Aoc1基因的表达水平，结果显示其在肠道中表达丰度最高（见图2a）。我们通过CRISPR-Cas9技术全身性敲除了小鼠的Aoc1基因（见图2b），构建了Aoc1−/−小鼠品系。为验证小鼠品系构建是否成功，本研究解剖了三对Aoc1+/+小鼠和Aoc1−/−小鼠，提取十二指肠、空肠和回肠的RNA和蛋白质，进行RT-PCR和western blot检测。RT-PCR结果（见图2c-d）显示Aoc1−/−小鼠体内Aoc1基因的敲低效率达99.9%，western blot结果同样证明了Aoc1−/−小鼠的构建是成功的。
图2
Aoc1−/−小鼠品系构建
a.
a.
2.3 Aocl−/−小鼠在高脂饮食条件下体脂增加
肥胖个体的体脂分布、代谢特征以及相关的代谢风险程度各不相同[10]。为了研究敲除Aoc1对脂质代谢产生的影响，我们分析了Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠在标准饮食和高脂饮食条件下的体重和体成分变化。结果显示，在标准饮食条件下，Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠体重和体成分无显著差异（具体数据见附件2）；在高脂饮食条件下，虽然二者体重无显著差异，但Aoc1−/−小鼠体脂率显著高于Aoc1+/+小鼠，瘦体重含量相较于Aoc1+/+小鼠则显著下降（见图3）。
图3
高脂饮食下Aoc1−/−小鼠脂肪积累增加（*P < 0.05，**P < 0.01）
Figure3.
Lipid accumulation increased in Aoc1−/− mice on HFD (*P < 0.05, **P < 0.01)
2.4 敲除Aoc1导致小鼠的葡萄糖耐受不良
脂质积累的增加通常会导致糖耐受度的变化[11]，因此我们对不同饮食条件下的Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠分别进行了OGTT和ITT实验。在标准饮食喂养组，Aoc1的缺失并未影响小鼠的葡萄糖耐受（具体数据见附件3）。而在高脂饮食喂养组，敲除Aoc1使得小鼠葡萄糖耐受减退，在灌胃葡萄糖后Aoc1−/−小鼠血糖水平显著高于Aoc1+/+小鼠；腹腔注射胰岛素后二者血糖变化一致，Aoc1−/−小鼠血糖水平略高，但差异无统计学意义（见图4）。
图4
敲除Aoc1导致小鼠的葡萄糖耐受不良（*P<0.05）
Figure4.
Knockout of Aoc1 impaired glucose tolerance in mice (*P<0.05)
2.5 敲除Aoc1不影响进食与能量消耗
为了进一步探究Aoc1−/−小鼠脂质代谢平衡发生的变化，本研究对高脂饮食条件下的Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠进行了代谢笼实验。结果显示，二者在进食量、氧气消耗速率、二氧化碳产生速率、呼吸交换率、热量消耗和活动量等方面均未产生显著差异（见图5）。Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠在呼吸交换率（respiratory exchange ratio，RER）水平上未体现出差异，说明敲除Aoc1并未改变小鼠对能量利用的偏好。小鼠进食量无显著差异证明小鼠的能量摄入并未增加，而产热和活动量无显著差异则证明能量消耗没有增加，因此我们认为，高脂饮食条件下Aoc1−/−小鼠体脂增高，并非是进食量增加或能量消耗减少所导致的，具体原因还需进一步探索。
图5
敲除Aoc1不影响进食与产热
黑白区间代表光周期，运动次数代表小鼠在
the black and white intervals represent the photoperiod, and the movement counts represent the total activity of the mice along the
2.6 缺失Aoc1导致白色脂肪组织与肝脏的脂质积累增加
上述结果指出，敲除Aoc1未影响小鼠进食量和热量消耗，但却能引起脂肪积累，糖耐量减退。为了进一步探究脂质积累增加发生的具体部位，我们将高脂饮食组小鼠安乐死，对小鼠的各个组织进行称重和取样分析。结果显示，Aoc1−/−小鼠的腹股沟白色脂肪组织（inguinal white adipose tissue，iWAT）和肝脏重量显著增加（见图6左图）。脂肪是机体主要的能量储存部位，肝脏则是短期脂肪存储和转换的场所，二者在脂质的储存与利用中发挥着重要作用[12]。我们测定了肝脏中的脂质含量，结果显示，Aoc1−/−小鼠肝脏甘油三酯的含量显著增高（见图6右图）。
图6
高脂饮食下Aoc1−/−小鼠iWAT与肝脏脂质积累增加（*P < 0.05）
Figure6.
Lipid accumulation of iWAT and liver increased in Aoc1−/− mice on HFD (*P < 0.05)
2.7 敲除Aoc1不影响小鼠肝脏脂质合成和葡萄糖代谢
在高脂饮食条件下，敲除Aoc1后小鼠iWAT与肝脏的重量增加，肝脏中甘油三酯的含量也显著增加，因此我们对肝脏脂质合成和葡萄糖代谢相关的基因水平进行了RT-PCR分析。结果显示，在高脂饮食条件下，相比于Aoc1+/+小鼠，Aoc1−/−小鼠肝脏中脂质合成和葡萄糖代谢的相关基因表达水平无显著变化（见图7）。
图7
敲除Aoc1不影响脂质合成和葡萄糖代谢基因表达
Figure7.
Knockout of Aoc1 did not affect gene expression of lipid synthesis and glucose metabolism
3 讨论
AOC1是多胺代谢的关键酶，多胺代谢失调在癌症中十分常见[13]。既往AOC1的相关研究大部分集中在癌症领域，包括胃癌、结直肠癌、前列腺癌、鼻咽癌和肝细胞癌[14-16]。有研究构建了Aoc1−/−小鼠，但其主要聚焦于敲除Aoc1后对组胺代谢的影响，未研究AOC1与脂质代谢之间的关系[17]。截至目前，关于AOC1在脂质代谢中的功能研究十分有限。
通过遗传学分析，本研究发现AOC1与体重、BMI、舒张压、血清白蛋白和高密度脂蛋白胆固醇等多个代谢指标强相关。有研究指出在大鼠十二指肠中输注脂质，可观察到淋巴管内组胺浓度和AOC1活性显著增加，并在输注后1 h同时达到峰值，这表明AOC1与脂质吸收之间存在关联[18]。因此，我们认为AOC1可能在脂质代谢中发挥重要生物学作用。
本研究通过构建Aoc1−/−小鼠品系并分析代谢表型，直观地观察敲除Aoc1对脂质代谢的影响。结果显示，在高脂饮食条件下，Aoc1−/−小鼠和Aoc1+/+小鼠相比，体脂率显著增高，葡萄糖耐受减退，iWAT与肝脏重量显著增加，表现出了更差的代谢表型，这与遗传学分析结果是一致的，证明敲除Aoc1会导致小鼠代谢表型显著改变。
Aoc1−/−小鼠体脂率显著增加，表明其脂质积累增加，因此我们猜测AOC1可能影响了小鼠的脂质代谢平衡。代谢笼检测证明，Aoc1−/−小鼠与Aoc1+/+小鼠相比，进食量和能量消耗并无显著差异，对能量物质的利用偏好也无显著差异，因此脂质代谢平衡被破坏并非发生在能量食物摄取和能量消耗环节，我们推断可能是脂质吸收或合成水平发生了变化，如脂质吸收或合成水平增加，均可以在进食和消耗无差异的情况下导致脂质积累增加。因此，后续我们计划通过橄榄油灌胃实验、小肠切片油红染色以及测定粪便内甘油三酯含量等方法，检测肠道脂质吸收有无差异；并通过测定脂肪酸合成和氧化关键酶的基因表达水平以及活性变化，检测脂质合成能力的变化。
在高脂饮食条件下，Aoc1−/−小鼠与Aoc1+/+小鼠相比，脂质合成和葡萄糖代谢基因的表达水平并未发生显著变化。我们推测这可能证明肝脏脂质异常积累并非是脂质合成增加引起的，也可能是由于高脂饮食喂养时间过长，引起小鼠产生代谢适应和代偿机制，因此掩盖了基因表达的初始差异。后续的研究中，我们会缩短高脂饮食喂养时间，测定肝脏和脂肪中的脂肪酸氧化基因的表达水平，以进一步验证Aoc1缺失对脂肪酸氧化通路的影响。
Aoc1在肠道中CT值范围为17至21，而在肝脏和脂肪组织中的CT值范围为25至26，这表明尽管Aoc1在肠道中表达最高，但在肝脏和脂肪组织中仍有相对较低的表达。为了更好地探究AOC1是否在不同组织中发挥不同的代谢调控功能，我们后续将通过Aoc1f/f小鼠分别和Villin-cre、Albumin-cre和AdipoQ-cre小鼠交配，得到肠道、肝脏和脂肪组织特异性敲除小鼠，具体去探究AOC1在各个组织当中发挥着怎样的功能。
AOC1是胞外代谢组胺的必需酶，催化组胺的氧化降解。组胺在外周组织可作为炎症因子，参与调节免疫反应和炎症发展的过程[19]。肥胖会引起慢性持续性低度炎症，这种炎症状态已被证明是导致胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢性疾病的关键因素之一[20-21]。在脂肪组织中，我们推测敲除Aoc1可能通过抑制组胺降解，促进脂肪组织的炎症状态，进而促进了脂肪组织重塑和扩张。后续我们将通过检测脂肪组织中组胺浓度以及组胺引起的炎症反应来验证这一可能性
近年来有研究报道了铜稳态和脂质代谢之间的联系[22–25]。细胞水平的实验证明，胞内铜水平升高会促进脂质水解，铜水平下降则减少脂解反应的发生[26]。在白色脂肪组织中，铜通过影响SSAO酶的活性来调控脂解反应[26]。SSAO的活性随局部铜含量的增多而增高，激活的SSAO可以反过来刺激葡萄糖和长链脂肪酸的摄取[27-28]。SSAO−/−小鼠的白色脂肪组织会增大，并产生轻度肥胖[29]。这与本研究的结果一致，高脂饮食下Aoc1−/−小鼠的体脂含量更高，iWAT重量增加，因此本研究推断AOC1可能存在与SSAO类似的功能，并通过铜稳态参与调节脂质代谢，未来我们将会进一步探究铜稳态在AOC1介导的脂质代谢中的作用。
4 结论
本研究从代谢研究的角度出发，通过高脂饮食喂养构建出Aoc1−/−小鼠的肥胖模型，并观察到Aoc1−/−小鼠体脂率显著增高、葡萄糖耐受减退、白色脂肪组织和肝脏重量显著增加等代谢表型，证明了AOC1在脂质代谢平衡中发挥着重要作用。此发现加深了我们对AOC1功能的了解，有助于揭示其在脂质代谢调节中的具体作用和潜在机制，在未来的研究中我们将进一步探究AOC1对于脂质代谢的影响。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：向思婷、刘莘颖和李匡政主要负责数据处理、数据分析与论文写作；赵同金和王旭主要负责实验指导、写作指导和论文审阅。
伦理声明：本研究通过了复旦大学伦理委员会的审批（批文编号：2020代谢整合院JS-006）。
本文附件见本刊网站的电子版本（biomedeng.cn）。
0 引言
含铜胺氧化酶是一类可以催化生物胺脱氨氧化，生成相应的醛，并将氧气还原为过氧化氢的酶[1]。哺乳动物含铜胺氧化酶家族主要由AOC1、AOC2、AOC3和AOC4构成。AOC1编码二胺氧化酶，AOC2和AOC3编码氨基脲敏感性胺氧化酶（semicarbazide-sensitive amine oxidase，SSAO），AOC4仅在某些动物中完整表达[2]。
AOC1又被称为二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO），绝大部分被储存于细胞内，在刺激下会被释放到局部，仅小部分会出现在外周循环中，半衰期约为1 h[2]。AOC1的主要底物为组胺和腐胺，在人的肠道、肾脏等组胺/腐胺摄取和排泄部位的表达丰度最高[3]。AOC1是胞外降解组胺的必需酶，组胺不耐受患者常表现出血清AOC1降低的表型[4]。AOC1还被报道与癌症密切相关，癌细胞中AOC1的升高会促进肿瘤增殖、侵袭和迁移，下调AOC1可以抑制肿瘤生长[5-6]。AOC1催化的酶促反应受到多种因素的调控，包括铜、pH值、底物浓度和抑制剂等。铜是AOC1的必需辅因子，直接参与电子转移过程，促进底物的氧化，铜离子的缺乏会显著降低AOC1的活性[7]。
目前尚无AOC1在脂质代谢调节过程中发挥作用的相关报道。为了探究AOC1是否存在其他未知的功能，我们利用T2DKP数据库[8]对AOC1进行了遗传学分析，构建Aoc1全身敲除小鼠（Aoc1−/−），并在标准饮食与高脂饮食饲养条件下鉴定其代谢表型，探讨了AOC1在机体脂质代谢中的功能，为相关疾病的治疗与新药研发提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
实验动物选用雄性C57BL/6小鼠和Aoc1−/−小鼠，体重（20±1）g。Aoc1+/−小鼠（株NO.T027589）购自集萃药康（中国南京）。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2019-0002；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0032。高脂饮食组小鼠8对，标准饮食组小鼠6对。高脂饲料购自美国Research Diets公司，货号D12492。标准饲料购自南京协同，货号1010084。
1.1.2 主要试剂及配方
试剂：蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂I、磷酸酶抑制剂II购自美国MCE公司；EDTA、NaCl购自上海生工公司；HEPES-Na、SDS购自美国Sigma公司；Na2HPO4、KH2PO4、KCl购自国药沪试公司；Tween-20购自美国Thermo公司；氯仿、甲醇购自国药集团；Wako LabAssayTM试剂盒购自富士胶片和光（广州）贸易有限公司；AOC1抗体购自美国Proteintech公司，16338-1-AP；GAPDH抗体购自美国Proteintech公司，60004-1-Ig。
配方：Buffer B（2 mmol/L EDTA，100 mmol/L HEPES-Na，2.5% SDS）；PBST（8 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L KCl，140 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.4）。
1.1.3 主要仪器
电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，ME2002E）、核磁共振分析仪（美国Bruker公司，minispec LF50）、血糖仪和血糖试纸（美国拜尔公司，Contour plus）、小动物能量检测系统（美国Columbus公司，CLAMS-16M）、微量分光光度计(美国Thermo公司，WI53711)、多模块实时荧光定量PCR系统（美国Thermo公司，QuantStudio 7）、多用途金属浴（杭州奥盛公司，MiniT-H2C）、
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠体重与体成分数据收集
每周称量一次体重，每两周检测一次体成分。使用核磁共振分析仪进行小鼠身体组分测定，测定之前实验动物不需要麻醉和特殊准备。每两周周五的固定时间点测量体成分。
1.2.2 口服葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验
在口服葡萄糖耐受实验（oral glucose tolerance test，OGTT）中，将小鼠禁食16 h，上午9点测定小鼠体重和空腹血糖，根据体重灌胃葡萄糖（标准饮食小鼠灌胃2 g/kg葡萄糖，高脂饮食小鼠灌胃1 g/kg葡萄糖），在15、30、60、90、120 min测定小鼠血糖并记录。在胰岛素耐受实验（insulin tolerance test，ITT）中，将小鼠禁食6 h，下午2点测定小鼠体重和空腹血糖，然后腹腔注射胰岛素（标准饮食小鼠注射剂量为0.5 U/kg，高脂饮食小鼠注射剂量为1 U/kg），在15、30、60、90、120 min测定小鼠血糖并记录。
1.2.3 小肠上皮细胞的蛋白免疫印记法（western blot）
解剖小鼠，将粘连在十二指肠周围的胰腺剔除干净，分离十二指肠、空肠和回肠。将分离的肠道纵向剖开，在PBS缓冲液中清洗后，用盖玻片将小肠上皮细胞刮下，并转移至EP管内，液氮速冻保存。使用时，加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂I和磷酸酶抑制剂II的Buffer B研磨组织，并进行BCA定量，根据定量结果取适量匀浆液加入对应体积的5×SDS，95 ℃金属浴加热10 min后即可上样。SDS-PAGE电泳结束后，将分离好的蛋白转到PVDF膜上，4 ℃过夜孵育一抗，所用抗体为AOC1和GAPDH。次日上午，用PBST洗膜三次，二抗室温孵育1 h，使用ECL试剂盒进行显影。
1.2.4 肝脏脂质含量测定
取0.1 g左右的肝脏组织，在4 mL氯仿甲醇（2∶1）混合溶剂中研磨至无明显组织块。研磨完成后，加入800 μL生理盐水，混匀后在4 ℃、1 000 r/min条件下离心20 min。将下层有机相移动至5 mL玻璃容量瓶中，加入足量氯仿调整相分界线，使分界线靠近刻度线（略低），次日使用氯仿定容。在2 mL的圆底深孔板中，加入10 μL的Triton X-100与氯仿（2∶1）混合溶剂，根据Wako LabAssayTM试剂盒指导，逐一添加标准液以及20 μL的样品溶液至相应的孔中，混匀后将深孔板放入干燥箱中过夜。次日，每孔加入300 μL的Wako LabAssayTM显色剂，于37 ℃孵育箱中孵育。将样品转移至96孔酶标板中。在600 nm波长处测量吸光度，以确定样品中甘油三酯的浓度。
1.2.5 代谢笼分析
使用小动物能量检测系统进行代谢笼分析，检测笼温度为22 ℃，光周期为12 h明/12 h暗。实验前一周将小鼠单独饲养，并适应代谢笼环境2天，随后对小鼠进行为期2天的代谢笼监测。
1.2.6 统计学分析方法
所有数据均使用SPSS 25.0软件进行统计分析，结果以均值±标准差表示，并使用OriginLab作图。组间比较采用学生t检验，检验水准为0.05。
2 结果
2.1 AOC1与代谢疾病强相关
为了寻找AOC1与代谢性疾病的潜在关联，我们利用T2DKP数据库对AOC1基因进行了遗传学分析。如图1a所示，通过基因与表型关联分析（关联性非常强：HuGE≥30[9]），我们发现AOC1与多种代谢指标，如体重、载脂蛋白a、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯等存在显著关联，这表明AOC1可能在代谢调节中起关键作用。如图1b所示，遗传变异分析显示，AOC1基因区域内存在多个与脂代谢相关的变异，可能会影响体重、体重指数（body mass index，BMI）、舒张压、血清白蛋白和高密度脂蛋白胆固醇等代谢指标（此处仅展示关联性较强的表型，完整数据参见附件1）。此结果表明AOC1可能在脂质代谢中发挥重要作用。
图1
AOC1与人类疾病关联性的综合分析结果
a：HuGE评分；b：
a. HuGE score; b. phenotypes that may be affected by variations within the
2.2 构建并验证Aoc1−/−小鼠
首先，我们在野生型小鼠（Aoc1+/+）的全身组织中检测了Aoc1基因的表达水平，结果显示其在肠道中表达丰度最高（见图2a）。我们通过CRISPR-Cas9技术全身性敲除了小鼠的Aoc1基因（见图2b），构建了Aoc1−/−小鼠品系。为验证小鼠品系构建是否成功，本研究解剖了三对Aoc1+/+小鼠和Aoc1−/−小鼠，提取十二指肠、空肠和回肠的RNA和蛋白质，进行RT-PCR和western blot检测。RT-PCR结果（见图2c-d）显示Aoc1−/−小鼠体内Aoc1基因的敲低效率达99.9%，western blot结果同样证明了Aoc1−/−小鼠的构建是成功的。
图2
Aoc1−/−小鼠品系构建
a.
a.
2.3 Aocl−/−小鼠在高脂饮食条件下体脂增加
肥胖个体的体脂分布、代谢特征以及相关的代谢风险程度各不相同[10]。为了研究敲除Aoc1对脂质代谢产生的影响，我们分析了Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠在标准饮食和高脂饮食条件下的体重和体成分变化。结果显示，在标准饮食条件下，Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠体重和体成分无显著差异（具体数据见附件2）；在高脂饮食条件下，虽然二者体重无显著差异，但Aoc1−/−小鼠体脂率显著高于Aoc1+/+小鼠，瘦体重含量相较于Aoc1+/+小鼠则显著下降（见图3）。
图3
高脂饮食下Aoc1−/−小鼠脂肪积累增加（*P < 0.05，**P < 0.01）
Figure3.
Lipid accumulation increased in Aoc1−/− mice on HFD (*P < 0.05, **P < 0.01)
2.4 敲除Aoc1导致小鼠的葡萄糖耐受不良
脂质积累的增加通常会导致糖耐受度的变化[11]，因此我们对不同饮食条件下的Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠分别进行了OGTT和ITT实验。在标准饮食喂养组，Aoc1的缺失并未影响小鼠的葡萄糖耐受（具体数据见附件3）。而在高脂饮食喂养组，敲除Aoc1使得小鼠葡萄糖耐受减退，在灌胃葡萄糖后Aoc1−/−小鼠血糖水平显著高于Aoc1+/+小鼠；腹腔注射胰岛素后二者血糖变化一致，Aoc1−/−小鼠血糖水平略高，但差异无统计学意义（见图4）。
图4
敲除Aoc1导致小鼠的葡萄糖耐受不良（*P<0.05）
Figure4.
Knockout of Aoc1 impaired glucose tolerance in mice (*P<0.05)
2.5 敲除Aoc1不影响进食与能量消耗
为了进一步探究Aoc1−/−小鼠脂质代谢平衡发生的变化，本研究对高脂饮食条件下的Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠进行了代谢笼实验。结果显示，二者在进食量、氧气消耗速率、二氧化碳产生速率、呼吸交换率、热量消耗和活动量等方面均未产生显著差异（见图5）。Aoc1+/+小鼠与Aoc1−/−小鼠在呼吸交换率（respiratory exchange ratio，RER）水平上未体现出差异，说明敲除Aoc1并未改变小鼠对能量利用的偏好。小鼠进食量无显著差异证明小鼠的能量摄入并未增加，而产热和活动量无显著差异则证明能量消耗没有增加，因此我们认为，高脂饮食条件下Aoc1−/−小鼠体脂增高，并非是进食量增加或能量消耗减少所导致的，具体原因还需进一步探索。
图5
敲除Aoc1不影响进食与产热
黑白区间代表光周期，运动次数代表小鼠在
the black and white intervals represent the photoperiod, and the movement counts represent the total activity of the mice along the
2.6 缺失Aoc1导致白色脂肪组织与肝脏的脂质积累增加
上述结果指出，敲除Aoc1未影响小鼠进食量和热量消耗，但却能引起脂肪积累，糖耐量减退。为了进一步探究脂质积累增加发生的具体部位，我们将高脂饮食组小鼠安乐死，对小鼠的各个组织进行称重和取样分析。结果显示，Aoc1−/−小鼠的腹股沟白色脂肪组织（inguinal white adipose tissue，iWAT）和肝脏重量显著增加（见图6左图）。脂肪是机体主要的能量储存部位，肝脏则是短期脂肪存储和转换的场所，二者在脂质的储存与利用中发挥着重要作用[12]。我们测定了肝脏中的脂质含量，结果显示，Aoc1−/−小鼠肝脏甘油三酯的含量显著增高（见图6右图）。
图6
高脂饮食下Aoc1−/−小鼠iWAT与肝脏脂质积累增加（*P < 0.05）
Figure6.
Lipid accumulation of iWAT and liver increased in Aoc1−/− mice on HFD (*P < 0.05)
2.7 敲除Aoc1不影响小鼠肝脏脂质合成和葡萄糖代谢
在高脂饮食条件下，敲除Aoc1后小鼠iWAT与肝脏的重量增加，肝脏中甘油三酯的含量也显著增加，因此我们对肝脏脂质合成和葡萄糖代谢相关的基因水平进行了RT-PCR分析。结果显示，在高脂饮食条件下，相比于Aoc1+/+小鼠，Aoc1−/−小鼠肝脏中脂质合成和葡萄糖代谢的相关基因表达水平无显著变化（见图7）。
图7
敲除Aoc1不影响脂质合成和葡萄糖代谢基因表达
Figure7.
Knockout of Aoc1 did not affect gene expression of lipid synthesis and glucose metabolism
3 讨论
AOC1是多胺代谢的关键酶，多胺代谢失调在癌症中十分常见[13]。既往AOC1的相关研究大部分集中在癌症领域，包括胃癌、结直肠癌、前列腺癌、鼻咽癌和肝细胞癌[14-16]。有研究构建了Aoc1−/−小鼠，但其主要聚焦于敲除Aoc1后对组胺代谢的影响，未研究AOC1与脂质代谢之间的关系[17]。截至目前，关于AOC1在脂质代谢中的功能研究十分有限。
通过遗传学分析，本研究发现AOC1与体重、BMI、舒张压、血清白蛋白和高密度脂蛋白胆固醇等多个代谢指标强相关。有研究指出在大鼠十二指肠中输注脂质，可观察到淋巴管内组胺浓度和AOC1活性显著增加，并在输注后1 h同时达到峰值，这表明AOC1与脂质吸收之间存在关联[18]。因此，我们认为AOC1可能在脂质代谢中发挥重要生物学作用。
本研究通过构建Aoc1−/−小鼠品系并分析代谢表型，直观地观察敲除Aoc1对脂质代谢的影响。结果显示，在高脂饮食条件下，Aoc1−/−小鼠和Aoc1+/+小鼠相比，体脂率显著增高，葡萄糖耐受减退，iWAT与肝脏重量显著增加，表现出了更差的代谢表型，这与遗传学分析结果是一致的，证明敲除Aoc1会导致小鼠代谢表型显著改变。
Aoc1−/−小鼠体脂率显著增加，表明其脂质积累增加，因此我们猜测AOC1可能影响了小鼠的脂质代谢平衡。代谢笼检测证明，Aoc1−/−小鼠与Aoc1+/+小鼠相比，进食量和能量消耗并无显著差异，对能量物质的利用偏好也无显著差异，因此脂质代谢平衡被破坏并非发生在能量食物摄取和能量消耗环节，我们推断可能是脂质吸收或合成水平发生了变化，如脂质吸收或合成水平增加，均可以在进食和消耗无差异的情况下导致脂质积累增加。因此，后续我们计划通过橄榄油灌胃实验、小肠切片油红染色以及测定粪便内甘油三酯含量等方法，检测肠道脂质吸收有无差异；并通过测定脂肪酸合成和氧化关键酶的基因表达水平以及活性变化，检测脂质合成能力的变化。
在高脂饮食条件下，Aoc1−/−小鼠与Aoc1+/+小鼠相比，脂质合成和葡萄糖代谢基因的表达水平并未发生显著变化。我们推测这可能证明肝脏脂质异常积累并非是脂质合成增加引起的，也可能是由于高脂饮食喂养时间过长，引起小鼠产生代谢适应和代偿机制，因此掩盖了基因表达的初始差异。后续的研究中，我们会缩短高脂饮食喂养时间，测定肝脏和脂肪中的脂肪酸氧化基因的表达水平，以进一步验证Aoc1缺失对脂肪酸氧化通路的影响。
Aoc1在肠道中CT值范围为17至21，而在肝脏和脂肪组织中的CT值范围为25至26，这表明尽管Aoc1在肠道中表达最高，但在肝脏和脂肪组织中仍有相对较低的表达。为了更好地探究AOC1是否在不同组织中发挥不同的代谢调控功能，我们后续将通过Aoc1f/f小鼠分别和Villin-cre、Albumin-cre和AdipoQ-cre小鼠交配，得到肠道、肝脏和脂肪组织特异性敲除小鼠，具体去探究AOC1在各个组织当中发挥着怎样的功能。
AOC1是胞外代谢组胺的必需酶，催化组胺的氧化降解。组胺在外周组织可作为炎症因子，参与调节免疫反应和炎症发展的过程[19]。肥胖会引起慢性持续性低度炎症，这种炎症状态已被证明是导致胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢性疾病的关键因素之一[20-21]。在脂肪组织中，我们推测敲除Aoc1可能通过抑制组胺降解，促进脂肪组织的炎症状态，进而促进了脂肪组织重塑和扩张。后续我们将通过检测脂肪组织中组胺浓度以及组胺引起的炎症反应来验证这一可能性
近年来有研究报道了铜稳态和脂质代谢之间的联系[22–25]。细胞水平的实验证明，胞内铜水平升高会促进脂质水解，铜水平下降则减少脂解反应的发生[26]。在白色脂肪组织中，铜通过影响SSAO酶的活性来调控脂解反应[26]。SSAO的活性随局部铜含量的增多而增高，激活的SSAO可以反过来刺激葡萄糖和长链脂肪酸的摄取[27-28]。SSAO−/−小鼠的白色脂肪组织会增大，并产生轻度肥胖[29]。这与本研究的结果一致，高脂饮食下Aoc1−/−小鼠的体脂含量更高，iWAT重量增加，因此本研究推断AOC1可能存在与SSAO类似的功能，并通过铜稳态参与调节脂质代谢，未来我们将会进一步探究铜稳态在AOC1介导的脂质代谢中的作用。
4 结论
本研究从代谢研究的角度出发，通过高脂饮食喂养构建出Aoc1−/−小鼠的肥胖模型，并观察到Aoc1−/−小鼠体脂率显著增高、葡萄糖耐受减退、白色脂肪组织和肝脏重量显著增加等代谢表型，证明了AOC1在脂质代谢平衡中发挥着重要作用。此发现加深了我们对AOC1功能的了解，有助于揭示其在脂质代谢调节中的具体作用和潜在机制，在未来的研究中我们将进一步探究AOC1对于脂质代谢的影响。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：向思婷、刘莘颖和李匡政主要负责数据处理、数据分析与论文写作；赵同金和王旭主要负责实验指导、写作指导和论文审阅。
伦理声明：本研究通过了复旦大学伦理委员会的审批（批文编号：2020代谢整合院JS-006）。
本文附件见本刊网站的电子版本（biomedeng.cn）。
