引用本文： 王丹, 张忠提, 王振华. 片仔癀联合多西他赛对舌鳞状细胞癌细胞生长及凋亡的影响. 华西医学, 2017, 32(6): 880-882. doi: 10.7507/1002-0179.201704054 复制
目前，舌鳞状细胞癌（鳞癌）的治疗以手术为主，辅以化学治疗（化疗）、放射治疗（放疗）的综合疗法，中晚期舌鳞癌 5 年生存率较低。手术会造成患者头面部外貌改变，可引起说话、吞咽等功能障碍，影响生活质量[1]。化疗药物则存在较大的毒副作用，在治疗时可考虑采用能在一定程度上有效控制癌细胞的扩散和转移、提高患者免疫力、减轻化疗药物毒副作用的中草药进行辅助治疗。多西他赛可阻滞肿瘤细胞有丝分裂，诱导细胞凋亡，对头颈部肿瘤、肺癌、胃癌等有良好的治疗效果[2-4]。片仔癀除可清热解毒、消肿止痛、活血化瘀外，对结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤等肿瘤增殖有一定抑制作用[5-7]。本研究拟探讨片仔癀联合多西他赛对舌鳞癌细胞 Tca8113 细胞生长、凋亡及细胞周期的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
人舌鳞癌细胞株 Tca8113 购自中国科学院上海细胞生物学研究所。片仔癀（漳州片仔癀药业股份有限公司）；多西他赛（山东齐鲁制药有限公司）；洛斯维·帕克纪念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）-1640 细胞培养基（美国 Gibco 公司）；AnnexinV-FITC 试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养方法 Tca8113 细胞为贴壁生长，用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养液，置于 37℃、5% 二氧化碳饱和湿度细胞培养箱中培养。取对数生长期的 Tca8113 细胞用于实验，设对照组、片仔癀单药组（450 μg/mL）、多西他赛单药组（0.01 μg/L）及片仔癀和多西他赛两药联合用药组。
1.2.2 流式细胞仪碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色对细胞周期的检测方法 将各实验组的 Tca8113 细胞接种于 6 孔培养板，培养 48 h 后收集细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗，2 000 r/min 离心 5 min（离心半径为 10.5 cm），细胞加预冷的 70% 乙醇于 –20℃ 固定，离心收集细胞，PBS 漂洗除去乙醇，用 500 μL PBS 重悬细胞，加入核糖核酸酶 A（终浓度为 0.25 mg/mL）和 5 μL PI 染液，避光孵育 30 min，用流式细胞仪进行检测。
1.2.3 流式细胞仪对细胞凋亡的检测方法 把各实验组细胞接种于 6 孔培养板中培养 48 h，收集细胞，PBS 洗涤细胞 2 次，加入 10 μL 的 Annexin Ⅴ，室温避光 15 min，加入 10 μL PI，室温避光 15 min，用流式细胞仪进行检测。
1.3 统计学方法
应用 SPSS 13.0 统计软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用 LSD-t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 片仔癀与多西他赛联合用药后 Tca8113 细胞形态的变化
倒置显微镜下观察，对照组细胞状态良好，贴壁生长，呈多角形且体积较大，细胞之间生长紧密（图 1a）。单独使用 450 μg/mL 的片仔癀或 0.01 μg/L 的多西他赛 48 h 后，可见部分细胞体积变小，形态变圆而钝，细胞间连接变稀疏，细胞内可出现空泡和颗粒（图 1b、1c）。联合用药组的细胞全面皱缩，细胞呈圆形且出现部分细胞破碎（图 1d）。
图1
倒置显微镜观察各组 Tca8113 细胞形态的变化（×200）
2.2 片仔癀与多西他赛联合用药对Tca8113细胞周期的影响
PI 染色检测结果显示，与对照组相比，单独使用片仔癀时细胞周期在 G0/G1 期发生阻滞，S 期比率下降（P<0.01）。单独使用多西他赛时细胞周期阻滞于 G2/M 期，显著高于对照组，S 期比率亦显著下降（P<0.01）。两药联合使用后细胞周期在 G0/G1 期和 G2/M 期均发生阻滞，与片仔癀单药组相比，G2/M 期比率显著增加；与多西他赛单药组相比，G0/G1 期比率显著增加（P<0.01）。见表 1。
表1
各组用药后 Tca8113 细胞周期的变化（
）
2.3 片仔癀与多西他赛联合用药对 Tca8113 细胞凋亡的影响
Annexin-Ⅴ/PI 双染实验结果显示，片仔癀单药组和多西他赛单药组与对照组相比均显著促进细胞凋亡（P<0.01）；两药联合应用时，其凋亡率较两药单独应用时均显著升高（P<0.01）。见图 2、3。
图2
各组不同用药对 Tca8113 细胞凋亡的影响
图3
各组不同用药对 Tca8113 细胞凋亡的影响
3 讨论
Ⅰ～Ⅱ期早期高分化舌癌患者可行手术或放疗，Ⅲ～Ⅳ期晚期舌癌患者为预防术后复发及远处转移，治疗方案以手术为主，辅以中草药配合的综合治疗。化疗有助于缩小肿瘤，适合怀疑有切除不彻底或远处转移的患者，可提高其生存率和治愈率，但化疗药物有较严重的诱发中性粒细胞减少、脱发、恶心呕吐等不良反应。在癌症的药物治疗中，常辅以中草药和西药配合增加疗效，减少化疗药物的副作用。片仔癀属于清热剂的中成药，可通过下调血管内皮生长因子-C 抑制结肠癌细胞的转移[8]；下调蛋白激酶 B 和雷帕霉素靶蛋白磷酸化表达，抑制卵巢癌细胞增殖，阻滞细胞周期进程[9]；通过抑制白细胞介素-6/信号传导与转录激活因子 3 信号通路抑制结肠癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡[10]。多西他赛为紫杉醇类的代表药物，通过促进微管双聚体组装成微管，又可防止去多聚化过程，抑制微管的解聚进而使微管稳定。微管蛋白二聚体可维持细胞形态，在细胞分裂期微管蛋白解聚形成纺锤体，有利于细胞分裂；多西他赛通过干扰微管蛋白解聚，抑制其分解，阻断细胞分裂周期中的 G2期和 M 期，导致细胞死亡，抑制肿瘤细胞生长[11]。
本研究中，多西他赛单药组 G2/M 比值较对照组显著增加，说明 G2/M 期细胞增多，细胞阻滞于 G2/M 期，促进细胞走向凋亡；片仔癀单药组 G0/G1 期比率较对照组显著增加，S 期细胞比率下降，说明片仔癀可使细胞周期阻滞于 G0/G1 期。两药合用后对 Tca8113 细胞 G0/G1 期和 G2/M 期均有阻滞作用，协同增强了药物对肿瘤细胞周期进程的抑制作用。倒置显微镜下亦观察到片仔癀与多西他赛联用诱发细胞呈凋亡样改变，细胞密度明显下降。且两药联合应用上调了 Tca8113 细胞的凋亡比率。
综上，片仔癀与多西他赛联合使用可抑制舌鳞癌细胞生长并促进细胞凋亡。
目前，舌鳞状细胞癌（鳞癌）的治疗以手术为主，辅以化学治疗（化疗）、放射治疗（放疗）的综合疗法，中晚期舌鳞癌 5 年生存率较低。手术会造成患者头面部外貌改变，可引起说话、吞咽等功能障碍，影响生活质量[1]。化疗药物则存在较大的毒副作用，在治疗时可考虑采用能在一定程度上有效控制癌细胞的扩散和转移、提高患者免疫力、减轻化疗药物毒副作用的中草药进行辅助治疗。多西他赛可阻滞肿瘤细胞有丝分裂，诱导细胞凋亡，对头颈部肿瘤、肺癌、胃癌等有良好的治疗效果[2-4]。片仔癀除可清热解毒、消肿止痛、活血化瘀外，对结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤等肿瘤增殖有一定抑制作用[5-7]。本研究拟探讨片仔癀联合多西他赛对舌鳞癌细胞 Tca8113 细胞生长、凋亡及细胞周期的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
人舌鳞癌细胞株 Tca8113 购自中国科学院上海细胞生物学研究所。片仔癀（漳州片仔癀药业股份有限公司）；多西他赛（山东齐鲁制药有限公司）；洛斯维·帕克纪念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）-1640 细胞培养基（美国 Gibco 公司）；AnnexinV-FITC 试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养方法 Tca8113 细胞为贴壁生长，用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养液，置于 37℃、5% 二氧化碳饱和湿度细胞培养箱中培养。取对数生长期的 Tca8113 细胞用于实验，设对照组、片仔癀单药组（450 μg/mL）、多西他赛单药组（0.01 μg/L）及片仔癀和多西他赛两药联合用药组。
1.2.2 流式细胞仪碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色对细胞周期的检测方法 将各实验组的 Tca8113 细胞接种于 6 孔培养板，培养 48 h 后收集细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗，2 000 r/min 离心 5 min（离心半径为 10.5 cm），细胞加预冷的 70% 乙醇于 –20℃ 固定，离心收集细胞，PBS 漂洗除去乙醇，用 500 μL PBS 重悬细胞，加入核糖核酸酶 A（终浓度为 0.25 mg/mL）和 5 μL PI 染液，避光孵育 30 min，用流式细胞仪进行检测。
1.2.3 流式细胞仪对细胞凋亡的检测方法 把各实验组细胞接种于 6 孔培养板中培养 48 h，收集细胞，PBS 洗涤细胞 2 次，加入 10 μL 的 Annexin Ⅴ，室温避光 15 min，加入 10 μL PI，室温避光 15 min，用流式细胞仪进行检测。
1.3 统计学方法
应用 SPSS 13.0 统计软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用 LSD-t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 片仔癀与多西他赛联合用药后 Tca8113 细胞形态的变化
倒置显微镜下观察，对照组细胞状态良好，贴壁生长，呈多角形且体积较大，细胞之间生长紧密（图 1a）。单独使用 450 μg/mL 的片仔癀或 0.01 μg/L 的多西他赛 48 h 后，可见部分细胞体积变小，形态变圆而钝，细胞间连接变稀疏，细胞内可出现空泡和颗粒（图 1b、1c）。联合用药组的细胞全面皱缩，细胞呈圆形且出现部分细胞破碎（图 1d）。
图1
倒置显微镜观察各组 Tca8113 细胞形态的变化（×200）
2.2 片仔癀与多西他赛联合用药对Tca8113细胞周期的影响
PI 染色检测结果显示，与对照组相比，单独使用片仔癀时细胞周期在 G0/G1 期发生阻滞，S 期比率下降（P<0.01）。单独使用多西他赛时细胞周期阻滞于 G2/M 期，显著高于对照组，S 期比率亦显著下降（P<0.01）。两药联合使用后细胞周期在 G0/G1 期和 G2/M 期均发生阻滞，与片仔癀单药组相比，G2/M 期比率显著增加；与多西他赛单药组相比，G0/G1 期比率显著增加（P<0.01）。见表 1。
表1
各组用药后 Tca8113 细胞周期的变化（
）
2.3 片仔癀与多西他赛联合用药对 Tca8113 细胞凋亡的影响
Annexin-Ⅴ/PI 双染实验结果显示，片仔癀单药组和多西他赛单药组与对照组相比均显著促进细胞凋亡（P<0.01）；两药联合应用时，其凋亡率较两药单独应用时均显著升高（P<0.01）。见图 2、3。
图2
各组不同用药对 Tca8113 细胞凋亡的影响
图3
各组不同用药对 Tca8113 细胞凋亡的影响
3 讨论
Ⅰ～Ⅱ期早期高分化舌癌患者可行手术或放疗，Ⅲ～Ⅳ期晚期舌癌患者为预防术后复发及远处转移，治疗方案以手术为主，辅以中草药配合的综合治疗。化疗有助于缩小肿瘤，适合怀疑有切除不彻底或远处转移的患者，可提高其生存率和治愈率，但化疗药物有较严重的诱发中性粒细胞减少、脱发、恶心呕吐等不良反应。在癌症的药物治疗中，常辅以中草药和西药配合增加疗效，减少化疗药物的副作用。片仔癀属于清热剂的中成药，可通过下调血管内皮生长因子-C 抑制结肠癌细胞的转移[8]；下调蛋白激酶 B 和雷帕霉素靶蛋白磷酸化表达，抑制卵巢癌细胞增殖，阻滞细胞周期进程[9]；通过抑制白细胞介素-6/信号传导与转录激活因子 3 信号通路抑制结肠癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡[10]。多西他赛为紫杉醇类的代表药物，通过促进微管双聚体组装成微管，又可防止去多聚化过程，抑制微管的解聚进而使微管稳定。微管蛋白二聚体可维持细胞形态，在细胞分裂期微管蛋白解聚形成纺锤体，有利于细胞分裂；多西他赛通过干扰微管蛋白解聚，抑制其分解，阻断细胞分裂周期中的 G2期和 M 期，导致细胞死亡，抑制肿瘤细胞生长[11]。
本研究中，多西他赛单药组 G2/M 比值较对照组显著增加，说明 G2/M 期细胞增多，细胞阻滞于 G2/M 期，促进细胞走向凋亡；片仔癀单药组 G0/G1 期比率较对照组显著增加，S 期细胞比率下降，说明片仔癀可使细胞周期阻滞于 G0/G1 期。两药合用后对 Tca8113 细胞 G0/G1 期和 G2/M 期均有阻滞作用，协同增强了药物对肿瘤细胞周期进程的抑制作用。倒置显微镜下亦观察到片仔癀与多西他赛联用诱发细胞呈凋亡样改变，细胞密度明显下降。且两药联合应用上调了 Tca8113 细胞的凋亡比率。
综上，片仔癀与多西他赛联合使用可抑制舌鳞癌细胞生长并促进细胞凋亡。
