引用本文： 卞泗善, 苏庆红, 肖毅, 徐展望. FBS对成骨生长肽促进BMSCs增殖分化的影响. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(2): 221-226. doi: 10.7507/1002-1892.20150047 复制
成骨生长肽（osteogenic growth peptide，OGP）是一种具有促进成骨作用的多肽类成骨生长因子，研究表明其在促进骨折愈合以及预防、治疗骨质疏松症方面具有良好效果，同时在骨组织工程等方面也具有潜在应用前景[1-2]。OGP促进成骨作用主要是促进骨源细胞BMSCs的增殖及向成骨细胞方向的特定分化[3]，因此其促进BMSCs增殖分化的作用越来越受到关注。但OGP促进BMSCs增殖分化的作用浓度一直存在争议，王璐等[4]认为OGP浓度为1×10-9 mol/L时促增殖作用最强，1×10-8 mol/ L时促成骨能力最强；而徐杨等[5]提出1×10-9 mol/ L浓度下促成骨能力最强；肖毅等[6]研究表明，1×10-11～1×10-10 mol/L浓度范围均能促进细胞增殖。相同药物作用于相同细胞，其药物最佳作用浓度差异较大，因此需要进一步探讨培养体系对药物作用于细胞的影响因素。FBS是细胞体外培养体系中不可缺少的组分，但FBS富含有丝分裂因子及多种细胞因子，具有促增殖和分化的作用，对BMSCs的实验结果有一定影响[7]。目前，关于培养体系中FBS对OGP影响的研究罕见报道。为此，本实验初步探究不同浓度FBS对OGP促进BMSCs增殖分化的影响，以期为体外细胞实验选择合理的OGP浓度和血清浓度提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级5周龄SD大鼠8只，雌雄不限，体重(100±10) g，购自山东中医药大学实验动物中心。L-DMEM培养基、青-链霉素(GIBCO公司，美国)；FBS（天津康源生物技术有限公司）；OGP、MTT、胰蛋白酶、对硝基苯磷酸二钠（p-nitrophenyl phosphate disodium，pNPP）、Triton X-100（北京博奥森生物技术有限责任公司）；BCA蛋白测定试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）。
超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；Sorvall T21高速低温离心机（Sorvall Products公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；CO2培养箱（TAI ESPEC公司，日本）；酶标仪（Bio-Tek公司，美国）。
1.2 BMSCs分离、培养与传代
取SD大鼠拉颈脱臼处死，75%乙醇浸泡5 min，无菌条件下分离四肢股骨与胫骨，剪开两端骨骺，用无菌注射器吸入含10%FBS的L-DMEM培养基，反复冲洗股骨与胫骨骨髓腔，收集冲洗液。用L-DMEM培养基调整细胞密度为1×107个/mL，接种至100 mL塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养，每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。待细胞生长至瓶底面积80%后，加入0.25%胰蛋白酶消化传代，取第3代形状典型的BMSCs进行实验。
1.3 MTT检测细胞增殖
取BMSCs以含10%FBS的L-DMEM培养基调整密度至1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔200 μL。于37℃、5%CO2培养箱孵育8 h使细胞完全贴壁，更换不含血清的L-DMEM培养基继续孵育12 h，使细胞周期同步，进行后续实验。每枚96孔板均铺设以下实验组，分别为OGP 1×10-10 mol/L组、OGP 1×10-9 mol/L组、OGP 1×10-8 mol/L组和正常培养对照组，各组同时设FBS浓度为0、2%、5%、8%和10% 5个梯度亚组，各亚组设3个复孔，每3天换液1次。分别在培养后1、3、5、7、9、12 d取1枚96孔板进行MTT检测，每孔加入10 μL MTT孵育4 h，弃去100 μL上清，补加100 μL 10%SDS，37℃过夜培养。酶标仪检测各孔570 nm波长处吸光度（A）值。
1.4 pNPP法测定细胞内ALP活性
取BMSCs以含10%FBS的L-DMEM培养基调整密度至1×105个/mL接种于6孔板中，每孔3 mL。同1.3方法培养后进行后续实验。实验分为OGP 1×10-10 mol/L、OGP 1×10-9 mol/L组、OGP 1×10-8 mol/L组和正常培养对照组，各组同时设FBS浓度为5%、8%和10% 3个梯度亚组，各亚组设3个复孔，每3天换液1次。培养第9天时刮取6孔板内细胞，以1 500 × g 离心2 min后收集细胞至1.5 mL离心管中。每支离心管加入含0.1%Triton X-100的细胞裂解液200～500 μL，4℃冰上裂解20 min。4℃以10 000 × g离心10 min，收集上层裂解液。按照BCA蛋白测定试剂盒方法测定裂解液中总蛋白浓度，以蛋白含量（μg）为横坐标，570 nm处A值为纵坐标，绘出总蛋白标准曲线，根据标准曲线算出样品实际浓度（g/L）。ALP活性标准曲线测量方法：制备pNPP反应液，并在405 nm波长下测定不同浓度对硝基苯酚的A值，以ALP的活性单位（μ/g protein）作为自变量，对应的A值为应变量求直线回归方程，得ALP活性反应的标准曲线。ALP活性的检测和计算：取20 μL裂解液上清于96孔板中，加入100 μL pNPP反应液，37℃反应15 min，NaOH终止反应，于405 nm波长处测定A值。参考ALP活性标准曲线查活力值，并根据总蛋白含量的测定值得到检测样品中每克蛋白所含的ALP活性值。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态观察
倒置相差显微镜观察示，分离的细胞呈球形，大小不一，细胞边缘清晰，胞体透亮，折光性强，为多种细胞相互混杂（图 1 a）。24 h后可见少量细胞贴壁生长，形态逐渐呈不规则状。首次换液后可见大量细胞伸展贴壁，呈棒状，偶可见明显伪足（图 1 b）。随培养时间延长，贴壁细胞数量继续增多，体积增大，形态逐渐呈梭形；悬浮杂细胞随着换液被弃除。7 d细胞增殖迅速，具有汇合趋势，密集处呈漩涡状分布（图 1 c）。细胞形态符合BMSCs的典型特征。
图1
细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 分离培养1 h ⓑ 培养3 d ⓒ 培养7 d 图 2 MTT检测各组细胞增殖变化 ⓐ FBS浓度为0 ⓑ FBS浓度为2% ⓒ FBS浓度为5% ⓓ FBS浓度为8% ⓔ FBS浓度为10% 图 3 各组ALP活性检测结果
Figure1.
Morphology observation of BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ At 1 hour after isolation culture ⓑ At 3 days after culture ⓒ At 7 days after culture Fig. 2 Proliferation changes of cells in each group at different FBS concentrations by MTT test ⓐ 0%FBS ⓑ 2%FBS ⓒ 5%FBS ⓓ 8%FBS ⓔ 10%FBS Fig. 3 The activity of ALP in each group
2.2 MTT检测细胞增殖
MTT检测示，当培养液中FBS浓度为0时，加入OGP后1、3、5 d时均能短时促进BMSCs增殖，各OGP组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），但各OGP浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）。5 d后各组细胞均进入生长平台期，随后开始老化死亡。见图 2 a。
当FBS浓度为2%时，加入OGP后1、3、5 d时均能促进BMSCs增殖，各OPG组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；各OGP浓度组间差异亦有统计学意义（P＜0.05），其中OGP 1×10-8 mol/L组促增殖效果最显著。但7、9、12 d时随着OGP剂量的降低，其促细胞增殖能力逐渐减弱（P＜0.05），呈现剂量依赖效应。见图 2 b。
当FBS浓度为5%时，各时间点各组细胞促增殖效果明显强于FBS浓度为0及2%时，差异有统计学意义（P＜0.05）。各OGP浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中OGP 1×10-8 mol/ L组促增殖效果最显著，各OGP浓度组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2 c。
当FBS浓度为8%时，各组细胞增殖差异更明显，各时间点对照组与OGP 1×10-8 mol/L组及OGP 1×10-9 mol/L组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但与OGP 1×10-10 mol/L组差异无统计学意义(P＞0.05) 。各OGP浓度组在各时间点均呈现出明显的剂量依赖效应，其中OGP 1×10-8 mol/L组促增殖效果大于OGP 1×10-9 mol/L组和OGP 1×10-10 mol/L组（P＜0.05）。见图 2 d。
当FBS浓度为10%时，OGP 1×10-10 mol/L组各时间点促增殖效果均低于对照组（P＜0.05）；OGP 1×10-9 mol/L组和OGP 1×10-8 mol/L组促增殖效果仍高于对照组（P＜0.05），但OGP 1×10-9 mol/L组和OGP 1×10-8 mol/L组差异缩小，差异无统计学意义(P＞0.05) ，OGP 1×10-8 mol/L组不再表现其促增殖的优势。对照组随着血清浓度由0增加到10%，细胞增殖加快，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 2 e。
2.3 细胞内ALP活性检测
各组组内随FBS浓度增加，ALP活性相应增加，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。同一FBS浓度组间比较：当FBS浓度为5%、8%时，各OGP浓度组ALP活性均大于对照组，并且随OGP浓度增大ALP活性也增加，OGP 1×10-8 mol/ L组ALP活性均高于其他OGP浓度组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。当FBS浓度为10%时，虽然各OGP浓度组ALP活性仍大于对照组（P＜0.05），但OGP 1×10-8 mol/L组与OGP 1×10-9 mol/L组比较差异已无统计学意义(P＞0.05) 。见图 3。
3 讨论
干细胞疗法已成为治疗各种疾病，包括创伤修复和组织再生的一种新方法[8]。BMSCs是一种存在于骨髓中的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在体外极易被扩增和定向分化为不同的细胞谱系[9]。体外培养BMSCs受培养基中的糖浓度、血清浓度、种植细胞密度、培养温度、培养pH值等多种因素影响[10]，Barry等[11]认为培养基中的FBS使BMSCs更易于向成骨分化。目前，体外培养BMSCs时常在基础培养基中添加牛血清以维持细胞增殖和生长，其可提供细胞所需的大多数因子，常添加浓度为10%的FBS。FBS一般来源于8～10月龄胎牛的血液，含有多种蛋白成分和含量不等的各种生长因子。血清中的生长因子是一组相对分子质量为（5～30）×103的蛋白，主要包括VEGF、EGF、FGF、NGF、PDGF和IGF，它们以特异的细胞表面受体作为生物起始信号，刺激细胞增殖和分化[12]。
BMSCs向特定细胞分化过程经历了增殖和分化两个阶段，一般认为这两个阶段是一动态平衡过程，良好的增殖将有利于更多干细胞向所需要的细胞分化[13]。OGP在体外实验中既能促进成骨细胞样细胞增殖，又能促进其骨向分化，提高ALP活性。ALP活性的增加是成骨细胞早期分化的指标之一，ALP可水解有机磷酸酯，进而释放磷酸盐，使得游离的磷酸盐与钙发生结合，形成磷酸钙沉积在细胞周围基质的胶原中，最终形成新生骨[14]。因此，本实验前期通过MTT检测OGP对BMSCs增殖的影响，后期选取ALP作为分化能力检测指标，以观察在OGP作用下BMSCs成骨分化情况，并观察不同血清浓度对增殖和分化的影响。
通过不同FBS浓度对3种浓度OGP促进BMSCs增殖的影响实验，我们发现当FBS浓度为0 和2%时，血清浓度太低不能为细胞生长提供必需营养，以致无法持续增殖；5%FBS浓度因细胞生长缓慢，难以达到大量增殖进而分化的目的。因此，无血清或低血清普通培养基无法促进干细胞增殖，这可能与血清会诱导细胞内的钙离子震荡，而钙离子震荡对细胞的增殖和分化具有重要作用有关[15]。而8%FBS浓度能够较好地促进细胞持续增殖，并使不同OGP浓度组间呈现出对细胞增殖的明显差异。10%浓度的FBS因各种生长因子含量相对较高，促进了干细胞的增殖，并干扰了OGP的增殖作用，这也说明FBS中的其他生长因子对BMSCs的增殖作用不容忽视。
ALP活性检测结果也提示，随着培养系统中血清含量的增加，ALP活性也相应变化。对照组ALP活性随着血清浓度升高呈微弱增加趋势，可能与高浓度血清促进了BMSCs中的少量前成骨细胞增殖有关。各OGP浓度组随FBS浓度的增加，ALP活性也显著增加，说明FBS通过诱导BMSCs增殖，从而增加了细胞分化数量。值得关注的是，8%FBS浓度中OGP 1×10-8 mol/L组ALP活性显著高于OGP 1×10-9 mol/L组，但10%FBS浓度中OGP 1×10-8 mol/ L组却不再表现促分化优势，说明10%FBS中可能含有较高浓度的其他成分对BMSCs增殖分化过程具有一定促进作用，干扰了实验中OGP最佳药物浓度的选择。
针对血清中含有的部分生长因子，有研究者[10]在低糖低血清条件下添加EGF，发现可促使MSCs体外扩增，认为EGF体外刺激MSCs增殖与其是酪氨酸激酶生长因子的主要受体有关。bFGF对MSCs的扩增无明显作用，但能改变MSCs的形态与克隆集落生成能力，在添加培养MSCs的生长因子时需引起注意[10]。血清中的PDGF是由2条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体，能刺激多种细胞如成骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等的分裂与增殖。PDGF可诱导c-jun基因的转录而影响增殖细胞核抗原的表达，从而刺激MSCs增殖[16]。IGF-1是含有70个氨基酸残基的单链碱性多肽，已有研究证实IGF-1在分化早期阶段主要激活MEK-ERK信号通路，通过剂量依赖方式诱导转录辅激活蛋白PDZ结合基序的表达，来促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化，从而增加BMSCs体外培养时ALP活性和骨钙素沉积的数量[17]。Binder等[18]研究也认为，10%的血清浓度对体外培养的细胞不是准确的生理环境，高水平血清对细胞增殖分化有影响。结合本研究MTT及ALP活性检测结果，提示10%FBS浓度会影响BMSCs的增殖分化，而8%FBS浓度能够保证BMSCs的持续生长，并且有利于对OGP最佳药物浓度的选择。
综上述，本研究通过检测对不同血清浓度培养条件下施加不同浓度的OGP诱导BMSCs增殖分化的情况，发现8%FBS的培养条件有利于检测OGP对BMSCs增殖和分化的影响，为优化BMSCs的体外培养条件奠定了实验基础，也为深入探索OGP促进BMSCs增殖和分化的作用机制提供了参考。
成骨生长肽（osteogenic growth peptide，OGP）是一种具有促进成骨作用的多肽类成骨生长因子，研究表明其在促进骨折愈合以及预防、治疗骨质疏松症方面具有良好效果，同时在骨组织工程等方面也具有潜在应用前景[1-2]。OGP促进成骨作用主要是促进骨源细胞BMSCs的增殖及向成骨细胞方向的特定分化[3]，因此其促进BMSCs增殖分化的作用越来越受到关注。但OGP促进BMSCs增殖分化的作用浓度一直存在争议，王璐等[4]认为OGP浓度为1×10-9 mol/L时促增殖作用最强，1×10-8 mol/ L时促成骨能力最强；而徐杨等[5]提出1×10-9 mol/ L浓度下促成骨能力最强；肖毅等[6]研究表明，1×10-11～1×10-10 mol/L浓度范围均能促进细胞增殖。相同药物作用于相同细胞，其药物最佳作用浓度差异较大，因此需要进一步探讨培养体系对药物作用于细胞的影响因素。FBS是细胞体外培养体系中不可缺少的组分，但FBS富含有丝分裂因子及多种细胞因子，具有促增殖和分化的作用，对BMSCs的实验结果有一定影响[7]。目前，关于培养体系中FBS对OGP影响的研究罕见报道。为此，本实验初步探究不同浓度FBS对OGP促进BMSCs增殖分化的影响，以期为体外细胞实验选择合理的OGP浓度和血清浓度提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级5周龄SD大鼠8只，雌雄不限，体重(100±10) g，购自山东中医药大学实验动物中心。L-DMEM培养基、青-链霉素(GIBCO公司，美国)；FBS（天津康源生物技术有限公司）；OGP、MTT、胰蛋白酶、对硝基苯磷酸二钠（p-nitrophenyl phosphate disodium，pNPP）、Triton X-100（北京博奥森生物技术有限责任公司）；BCA蛋白测定试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）。
超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；Sorvall T21高速低温离心机（Sorvall Products公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；CO2培养箱（TAI ESPEC公司，日本）；酶标仪（Bio-Tek公司，美国）。
1.2 BMSCs分离、培养与传代
取SD大鼠拉颈脱臼处死，75%乙醇浸泡5 min，无菌条件下分离四肢股骨与胫骨，剪开两端骨骺，用无菌注射器吸入含10%FBS的L-DMEM培养基，反复冲洗股骨与胫骨骨髓腔，收集冲洗液。用L-DMEM培养基调整细胞密度为1×107个/mL，接种至100 mL塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养，每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。待细胞生长至瓶底面积80%后，加入0.25%胰蛋白酶消化传代，取第3代形状典型的BMSCs进行实验。
1.3 MTT检测细胞增殖
取BMSCs以含10%FBS的L-DMEM培养基调整密度至1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔200 μL。于37℃、5%CO2培养箱孵育8 h使细胞完全贴壁，更换不含血清的L-DMEM培养基继续孵育12 h，使细胞周期同步，进行后续实验。每枚96孔板均铺设以下实验组，分别为OGP 1×10-10 mol/L组、OGP 1×10-9 mol/L组、OGP 1×10-8 mol/L组和正常培养对照组，各组同时设FBS浓度为0、2%、5%、8%和10% 5个梯度亚组，各亚组设3个复孔，每3天换液1次。分别在培养后1、3、5、7、9、12 d取1枚96孔板进行MTT检测，每孔加入10 μL MTT孵育4 h，弃去100 μL上清，补加100 μL 10%SDS，37℃过夜培养。酶标仪检测各孔570 nm波长处吸光度（A）值。
1.4 pNPP法测定细胞内ALP活性
取BMSCs以含10%FBS的L-DMEM培养基调整密度至1×105个/mL接种于6孔板中，每孔3 mL。同1.3方法培养后进行后续实验。实验分为OGP 1×10-10 mol/L、OGP 1×10-9 mol/L组、OGP 1×10-8 mol/L组和正常培养对照组，各组同时设FBS浓度为5%、8%和10% 3个梯度亚组，各亚组设3个复孔，每3天换液1次。培养第9天时刮取6孔板内细胞，以1 500 × g 离心2 min后收集细胞至1.5 mL离心管中。每支离心管加入含0.1%Triton X-100的细胞裂解液200～500 μL，4℃冰上裂解20 min。4℃以10 000 × g离心10 min，收集上层裂解液。按照BCA蛋白测定试剂盒方法测定裂解液中总蛋白浓度，以蛋白含量（μg）为横坐标，570 nm处A值为纵坐标，绘出总蛋白标准曲线，根据标准曲线算出样品实际浓度（g/L）。ALP活性标准曲线测量方法：制备pNPP反应液，并在405 nm波长下测定不同浓度对硝基苯酚的A值，以ALP的活性单位（μ/g protein）作为自变量，对应的A值为应变量求直线回归方程，得ALP活性反应的标准曲线。ALP活性的检测和计算：取20 μL裂解液上清于96孔板中，加入100 μL pNPP反应液，37℃反应15 min，NaOH终止反应，于405 nm波长处测定A值。参考ALP活性标准曲线查活力值，并根据总蛋白含量的测定值得到检测样品中每克蛋白所含的ALP活性值。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态观察
倒置相差显微镜观察示，分离的细胞呈球形，大小不一，细胞边缘清晰，胞体透亮，折光性强，为多种细胞相互混杂（图 1 a）。24 h后可见少量细胞贴壁生长，形态逐渐呈不规则状。首次换液后可见大量细胞伸展贴壁，呈棒状，偶可见明显伪足（图 1 b）。随培养时间延长，贴壁细胞数量继续增多，体积增大，形态逐渐呈梭形；悬浮杂细胞随着换液被弃除。7 d细胞增殖迅速，具有汇合趋势，密集处呈漩涡状分布（图 1 c）。细胞形态符合BMSCs的典型特征。
图1
细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 分离培养1 h ⓑ 培养3 d ⓒ 培养7 d 图 2 MTT检测各组细胞增殖变化 ⓐ FBS浓度为0 ⓑ FBS浓度为2% ⓒ FBS浓度为5% ⓓ FBS浓度为8% ⓔ FBS浓度为10% 图 3 各组ALP活性检测结果
Figure1.
Morphology observation of BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ At 1 hour after isolation culture ⓑ At 3 days after culture ⓒ At 7 days after culture Fig. 2 Proliferation changes of cells in each group at different FBS concentrations by MTT test ⓐ 0%FBS ⓑ 2%FBS ⓒ 5%FBS ⓓ 8%FBS ⓔ 10%FBS Fig. 3 The activity of ALP in each group
2.2 MTT检测细胞增殖
MTT检测示，当培养液中FBS浓度为0时，加入OGP后1、3、5 d时均能短时促进BMSCs增殖，各OGP组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），但各OGP浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）。5 d后各组细胞均进入生长平台期，随后开始老化死亡。见图 2 a。
当FBS浓度为2%时，加入OGP后1、3、5 d时均能促进BMSCs增殖，各OPG组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；各OGP浓度组间差异亦有统计学意义（P＜0.05），其中OGP 1×10-8 mol/L组促增殖效果最显著。但7、9、12 d时随着OGP剂量的降低，其促细胞增殖能力逐渐减弱（P＜0.05），呈现剂量依赖效应。见图 2 b。
当FBS浓度为5%时，各时间点各组细胞促增殖效果明显强于FBS浓度为0及2%时，差异有统计学意义（P＜0.05）。各OGP浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中OGP 1×10-8 mol/ L组促增殖效果最显著，各OGP浓度组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2 c。
当FBS浓度为8%时，各组细胞增殖差异更明显，各时间点对照组与OGP 1×10-8 mol/L组及OGP 1×10-9 mol/L组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但与OGP 1×10-10 mol/L组差异无统计学意义(P＞0.05) 。各OGP浓度组在各时间点均呈现出明显的剂量依赖效应，其中OGP 1×10-8 mol/L组促增殖效果大于OGP 1×10-9 mol/L组和OGP 1×10-10 mol/L组（P＜0.05）。见图 2 d。
当FBS浓度为10%时，OGP 1×10-10 mol/L组各时间点促增殖效果均低于对照组（P＜0.05）；OGP 1×10-9 mol/L组和OGP 1×10-8 mol/L组促增殖效果仍高于对照组（P＜0.05），但OGP 1×10-9 mol/L组和OGP 1×10-8 mol/L组差异缩小，差异无统计学意义(P＞0.05) ，OGP 1×10-8 mol/L组不再表现其促增殖的优势。对照组随着血清浓度由0增加到10%，细胞增殖加快，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 2 e。
2.3 细胞内ALP活性检测
各组组内随FBS浓度增加，ALP活性相应增加，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。同一FBS浓度组间比较：当FBS浓度为5%、8%时，各OGP浓度组ALP活性均大于对照组，并且随OGP浓度增大ALP活性也增加，OGP 1×10-8 mol/ L组ALP活性均高于其他OGP浓度组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。当FBS浓度为10%时，虽然各OGP浓度组ALP活性仍大于对照组（P＜0.05），但OGP 1×10-8 mol/L组与OGP 1×10-9 mol/L组比较差异已无统计学意义(P＞0.05) 。见图 3。
3 讨论
干细胞疗法已成为治疗各种疾病，包括创伤修复和组织再生的一种新方法[8]。BMSCs是一种存在于骨髓中的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在体外极易被扩增和定向分化为不同的细胞谱系[9]。体外培养BMSCs受培养基中的糖浓度、血清浓度、种植细胞密度、培养温度、培养pH值等多种因素影响[10]，Barry等[11]认为培养基中的FBS使BMSCs更易于向成骨分化。目前，体外培养BMSCs时常在基础培养基中添加牛血清以维持细胞增殖和生长，其可提供细胞所需的大多数因子，常添加浓度为10%的FBS。FBS一般来源于8～10月龄胎牛的血液，含有多种蛋白成分和含量不等的各种生长因子。血清中的生长因子是一组相对分子质量为（5～30）×103的蛋白，主要包括VEGF、EGF、FGF、NGF、PDGF和IGF，它们以特异的细胞表面受体作为生物起始信号，刺激细胞增殖和分化[12]。
BMSCs向特定细胞分化过程经历了增殖和分化两个阶段，一般认为这两个阶段是一动态平衡过程，良好的增殖将有利于更多干细胞向所需要的细胞分化[13]。OGP在体外实验中既能促进成骨细胞样细胞增殖，又能促进其骨向分化，提高ALP活性。ALP活性的增加是成骨细胞早期分化的指标之一，ALP可水解有机磷酸酯，进而释放磷酸盐，使得游离的磷酸盐与钙发生结合，形成磷酸钙沉积在细胞周围基质的胶原中，最终形成新生骨[14]。因此，本实验前期通过MTT检测OGP对BMSCs增殖的影响，后期选取ALP作为分化能力检测指标，以观察在OGP作用下BMSCs成骨分化情况，并观察不同血清浓度对增殖和分化的影响。
通过不同FBS浓度对3种浓度OGP促进BMSCs增殖的影响实验，我们发现当FBS浓度为0 和2%时，血清浓度太低不能为细胞生长提供必需营养，以致无法持续增殖；5%FBS浓度因细胞生长缓慢，难以达到大量增殖进而分化的目的。因此，无血清或低血清普通培养基无法促进干细胞增殖，这可能与血清会诱导细胞内的钙离子震荡，而钙离子震荡对细胞的增殖和分化具有重要作用有关[15]。而8%FBS浓度能够较好地促进细胞持续增殖，并使不同OGP浓度组间呈现出对细胞增殖的明显差异。10%浓度的FBS因各种生长因子含量相对较高，促进了干细胞的增殖，并干扰了OGP的增殖作用，这也说明FBS中的其他生长因子对BMSCs的增殖作用不容忽视。
ALP活性检测结果也提示，随着培养系统中血清含量的增加，ALP活性也相应变化。对照组ALP活性随着血清浓度升高呈微弱增加趋势，可能与高浓度血清促进了BMSCs中的少量前成骨细胞增殖有关。各OGP浓度组随FBS浓度的增加，ALP活性也显著增加，说明FBS通过诱导BMSCs增殖，从而增加了细胞分化数量。值得关注的是，8%FBS浓度中OGP 1×10-8 mol/L组ALP活性显著高于OGP 1×10-9 mol/L组，但10%FBS浓度中OGP 1×10-8 mol/ L组却不再表现促分化优势，说明10%FBS中可能含有较高浓度的其他成分对BMSCs增殖分化过程具有一定促进作用，干扰了实验中OGP最佳药物浓度的选择。
针对血清中含有的部分生长因子，有研究者[10]在低糖低血清条件下添加EGF，发现可促使MSCs体外扩增，认为EGF体外刺激MSCs增殖与其是酪氨酸激酶生长因子的主要受体有关。bFGF对MSCs的扩增无明显作用，但能改变MSCs的形态与克隆集落生成能力，在添加培养MSCs的生长因子时需引起注意[10]。血清中的PDGF是由2条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体，能刺激多种细胞如成骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等的分裂与增殖。PDGF可诱导c-jun基因的转录而影响增殖细胞核抗原的表达，从而刺激MSCs增殖[16]。IGF-1是含有70个氨基酸残基的单链碱性多肽，已有研究证实IGF-1在分化早期阶段主要激活MEK-ERK信号通路，通过剂量依赖方式诱导转录辅激活蛋白PDZ结合基序的表达，来促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化，从而增加BMSCs体外培养时ALP活性和骨钙素沉积的数量[17]。Binder等[18]研究也认为，10%的血清浓度对体外培养的细胞不是准确的生理环境，高水平血清对细胞增殖分化有影响。结合本研究MTT及ALP活性检测结果，提示10%FBS浓度会影响BMSCs的增殖分化，而8%FBS浓度能够保证BMSCs的持续生长，并且有利于对OGP最佳药物浓度的选择。
综上述，本研究通过检测对不同血清浓度培养条件下施加不同浓度的OGP诱导BMSCs增殖分化的情况，发现8%FBS的培养条件有利于检测OGP对BMSCs增殖和分化的影响，为优化BMSCs的体外培养条件奠定了实验基础，也为深入探索OGP促进BMSCs增殖和分化的作用机制提供了参考。
