引用本文： 康小文, 孔凡武, 张薇, 王欣燕, 黄坤, 李兆国, 吴晓梅. 高糖经由 ROS 或 TGF-β1/PI3K/Akt 信号途径促进肺腺癌 A549 细胞 HO-1 表达增加 . 中国呼吸与危重监护杂志, 2017, 16(1): 40-45. doi: 10.7507/1671-6205.201605052 复制
血红素加氧酶（heme oxygenase，HO）是一种微粒体酶，在人和哺乳动物体内广泛存在，参与多种生理和病理过程，是血红素代谢的起始酶和限速酶，在细胞抗氧化应激、炎症反应、增殖中起着重要作用。近年研究发现在多种肿瘤组织中 HO-1 表达增多，并已在人腺癌、前列腺癌、口腔鳞状细胞癌、食管癌、黑色素瘤和胰腺癌等多种实体肿瘤研究中得到证实[1–2]。研究发现高糖增加肿瘤细胞的侵袭能力如 MCF-7 乳腺癌细胞[3–4]、胰腺癌细胞[5]。而且 HO-1 与肿瘤细胞的淋巴结转移相关，与肺癌的进展相关[6]。非小细胞肺癌患者 HO-1 表达增多，有着更差的预后以及更高的转移发生率[7]。糖尿病患者 HO-1 的表达上调[8]，然而在糖尿病合并肺癌的人群中 HO-1 表达情况尚不清楚。因此在本实验中，我们在体外用高糖作用于肺腺癌上皮细胞系 A549 细胞，观察高糖对 HO-1 蛋白和 mRNA 的表达及 HO-1 活性的影响及其潜在机制，为肺癌合并糖尿病人群临床治疗提供新的靶点。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人 A549 细胞系（中科院上海细胞库），DMEM高糖培养基（Hyclone 公司），DMEM 低糖培养基（Hyclone 公司），胎牛血清 FBS（Gibco 公司），胰酶 TRYPSIN（Invitrogen 公司），2′, 7′-dichloro- dihydrofluorescin diacetate（DCFH-DA，Sigma），活性氧（ROS）抑制剂 N-乙酰半胱氨酸（NAC），人血红素加氧酶 1（HO-1）酶联免疫试剂盒，HO-1 引物；GAPDH 引物；高容量 cDNA 反转录试剂盒；SYBR Green PCR Master Mix（ABI Applied Biosystems 公司）。
1.2 实验方法和检测指标
1.2.1 细胞培养 从液氮罐中取出冻存管，迅速放入 37 ℃ 的水浴锅中复温。在离心管中，加入约 5 ml低糖培养液培养液，将冻存管中解冻后的悬液吸出，加入离心管内的培养液中，吹打几下，密封离心（1 000 r/min，5 min），弃上清，用 RPMI1640+10% FBS适当稀释后，移入培养瓶中，置于培养箱中，37 ℃ 5% CO2常规培养。细胞生长至 80% 融合时，用胰蛋白酶消化传代，继续培养。为研究 A549 细胞功能，选择第 3～15 代的 A549 细胞用于进一步实验操作。
1.2.2 Western blot 检测 HO-1 表达 Western blot 按照试剂盒说明进行，A549 细胞给予不同预处理后提取蛋白，然后测浓度、煮样，在10% 的凝胶上电泳，300 mA 转膜 50 min，在 5% 的脱脂牛奶中室温封闭 2 h，在 4 ℃ 摇床孵育过夜，然后洗膜扫膜。β-actin 为内参照。
1.2.3 逆转录 PCR 技术 为观察高糖等处理对 A549 细胞 HO-1 mRNA 表达水平的影响，进行 Real-time RT-PCR 的实验研究。提取 A549 细胞 RNA，根据 Applied Biosystems 高通量 cDNA Reverse Transcription Kit 操作步骤完成，并放置于逆转录系统（Eppendorf Mastercycler公司）中进行 cDNA 合成。参照 ABI Applied Biosystems 公司的 SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒操作步骤进行。将 cDNA 样本取出，用 Real-time PCR 实验进行定量分析。总量 20 μl的Real-time PCR 反应体系主要由10 μl SYBR Green PCR Master Mix（ABI Applied Biosystems公司），1 μl 上游引物，1 μl 下游引物，1 μl cDNA 模板和去离子水 7 μl，组成 20 μl 总体系。将混合好的溶液加入 96 孔板中（冰上操作），瞬时离心。Realtime PCR反应主要在 ABI Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 7500 Real-time PCR 系统运行此实验。反应条件为：95 ℃ 10 min 预变性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环。溶解曲线为：95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min。所用引物均由 Primer 5 设计软件进行设计。HO-1 基因的引物序列如下：HO-1 sense，5′-TTC TTC ACC TTC CCC AAC TA-3′；antisense，5′-GCA TAA AGC CCT ACA GCA AC-3′。
1.2.4 细胞 ROS 检测 通过检测 DCFH-DA 来检测细胞内 ROS 的含量。其基本原理是 DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由通过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解后形成不能通过细胞膜的 DCFH，从而使探针很容易被装载到细胞内，细胞内的 ROS 可以氧化无荧光的 DCFH 生成有荧光的 DCF，检测 DCF 的荧光间接判断细胞内活性氧的水平。将 A549 细胞根据实验要求进行分组，分组处理后的 A549 细胞用于 ROS 检测。用 PBS 轻轻的洗细胞 2 次，弃去 PBS，加入 10 μmol/L 的 DCFH-DA，避光 37 ℃，染色 45 min，然后用 PBS 清洗细胞，1 000g 离心。然后加入黑板内，在酶标仪下检测OD 值。
1.2.5 HO-1 活性及 TGF-β1 检测 A549 细胞给予不同预处理后，留取上清，用人 HO-1 酶联免疫试剂盒和 TGF-β1 试剂盒，按照说明书操作，酶标仪检测确定 HO-1 活性及高糖诱导细胞分泌 TGF-β1水平。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计分析软件，计量数据以均数±标准差（ ）表示。使用非配对t 检验进行统计。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 高糖增加 A549 细胞 HO-1 的表达
为了判断高糖对 A549 细胞 HO-1 表达的影响，采用 25 mmol/L 高糖分别处理 A549 细胞 0、24、48、72 h，然后提取蛋白和 RNA 进行实验。25 mmol/L高糖增加 A549 细胞 HO-1 表达并呈时间依赖性（图 1a和图 1c）。同时也给予0、10、25、40 mmol/L 浓度高糖处理 A549 细胞 48 h，结果显示高糖增加 A549细胞 HO-1 表达呈浓度依赖性（图 1b和图 1d）。为了排除渗透压的影响，用甘露醇 25 mmol/L 代替高糖处理细胞 48 h，结果显示甘露醇没有影响细胞 HO-1 的表达（图 2）。
图1
高糖对 HO-1 mRNA 和蛋白表达的影响
图2
甘露醇对 HO-1 蛋白表达的影响
2.2 高糖增加A549细胞HO-1的活性
用酶标仪通过检测胆红素的生成量确定 HO-1活性，高糖处理细胞 48 h 或过氧化氢（500 μmol/L）处理细胞 2 h 增加了 HO-1 的活性，而甘露醇没有增加 HO-1 活性，说明用抗氧化剂预处理细胞能够明显抑制高糖诱导 HO-1 活性的增加。结果见图 3。
图3
高糖和过氧化氢增加 A549 细胞 HO-1 酶活性
2.3 高糖诱导细胞 ROS 产生并介导 HO-1 表达
用 DCFH-DA 染色法检测高糖对细胞内 ROS 产生的影响。为了确定高糖是否能诱导细胞产生 ROS 以及 ROS 对 HO-1 表达的影响，分别用正常糖、高糖、高糖加 NAC 100 μmol/L、甘露醇处理 A549 细胞 48 h，用过氧化氢处理细胞 2 h。与对照组比较，高糖组细胞内 ROS 产生显著增多（图 4a）。甘露醇未能诱导细胞内ROS产生（图 4a）。如细胞预先用抗氧化剂 NAC 100 μmol/L 处理 30 min，然后给予高糖 25 mmol/L 作用于细胞 48 h，结果显示和高糖组相比，NAC 显著抑制细胞内 ROS 产生，并且显著减弱高糖诱导的 HO-1 表达（图 4c 和图 4d）。为了判断内源性氧化应激的角色，给予外源性过氧化氢 500 μmol/L 处理细胞 4 h，结果过氧化氢增加细胞内 ROS 产生（图4 a），并且增加细胞 HO-1 表达和 HO-1 酶活性（图 4b、图 4d 和图 3）。这些实验结果显示高糖增加细胞内 ROS 产生，并介导 HO-1 表达。
图4
高糖诱导细胞 ROS 产生并介导 HO-1 表达
2.4 PI3K/Akt 信号途径参与介导高糖诱导 HO-1表达
给予 PI3K 抑制剂（10 μmol/L）或 Akt 抑制剂（100 nmol/L）作用细胞 30 min，然后再给予高糖处理 48 h 或过氧化氢（500 μmol/L）2 h。结果显示 PI3K 抑制剂（10 μmol/L）或 Akt 抑制剂（100 nmol/L）均不同程度地抑制高糖诱导 HO-1 表达（图 5a），但 PI3K 抑制剂（10 μmol/L）或 Akt 抑制剂（100 nmol/L）没有抑制过氧化氢诱导 HO-1 表达（图5 b），提示 PI3K/Akt 信号途径参与高糖诱导 HO-1 表达，但不依赖于细胞内 ROS 产生。
图5
PI3K/Akt 信号途径在高糖诱导 HO-1 表达中的角色
2.5 高糖诱导 TGF-β1 产生并介导 HO-1 表达
用高糖处理细胞 48 h 后收集细胞液上清，然后用 TGF-β1 试剂盒检测 TGF-β1 的含量。结果显示与对照组比较，高糖增加 TGF-β1 的产生，然而甘露醇和过氧化氢没有诱导 TGF-β1 的产生（图 6a）。为了进一步证明 TGF-β1 在高糖诱导 HO-1 表达的角色，用 TGF-β1 2 ng/ml 作用于细胞，结果显示 TGF-β1诱导 A549 细胞 HO-1 表达增加，给予 PI3K 抑制剂（10 μmol/L）或 Akt 抑制剂（100 nmol/L）能够显著抑制 TGF-β1 诱导 HO-1 表达（图 6b）。这些实验结果表明 TGF-β1 经由 PI3K/Akt 信号途径参与高糖诱导 HO-1 表达。
图6
高糖诱导 TGF-β1 产生和 TGF-β1 在高糖诱导 HO-1 表达增加中的作用
3 讨论
流行病学资料显示糖尿病患者罹患各种恶性肿瘤的风险增加，如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和子宫内膜癌等，并且促进肿瘤发展和转移，这可能与糖尿病人群高水平的胰岛素和胰岛素样生长因子相关，也可能与糖尿病微血管病变使血管更容易被肿瘤细胞侵袭相关[8]。与其他器官一样，目前研究显示糖尿病也可促进肺癌的发生发展和转移，但糖尿病促进肺癌发展和转移的机制尚不明确。
HO-1 在一些代谢紊乱疾病中升高[9–11]。糖尿病患者血中 HO-1 水平升高与年龄、性别和体重指数无明显相关性，可能与一些特定器官损伤有关，如胰岛或胰腺 β 细胞损伤。本实验结果显示高糖增加 HO-1 蛋白和 RNA 表达，而且伴随 HO-1 表达的增加，同时 HO-1 的酶活性也增加，这一发现与视网膜内皮细胞的相关研究结果一致[12]。自发性糖尿病大鼠肝脏的 HO-1 表达水平较正常大鼠肝脏明显升高，提示在慢性高血糖状态下，HO-1 表达的升高可能参与了氧化性损伤的修复过程，高糖增加 HO-1表达的可能机制为高糖诱导 ROS 产生增加[13–14]。在 A549 细胞，正如在其他类型细胞一样[12,15]，ROS 能够促进 HO-1 表达上调[16]。本实验结果显示高糖诱导 ROS 产生，而抗氧化剂 NAC 能减少 ROS 的产生并且减弱高糖诱导 HO-1 的表达。本研究发现外源性 H2O2（500 μmol/L）可以增加 HO-1 的表达，这与在其他类型细胞相关研究结果一致[17–19]。
我们还发现 PI3K/Akt 信号途径在高糖诱导细胞 HO-1 表达中起重要作用。文献报道在其他类型细胞上 ROS 经 PI3K/Akt 信号途径诱导 HO-1 表达上调[21–22]，本研究发现 PI3K/Akt 信号途径的上游途径不是 ROS 而是 TGF-β1。高糖可诱导细胞产生TGF-β1[20]，而 TGF-β1 能够经由 PI3K/Akt 信号途径上调 HO-1 表达[7]，TGF-β1 还可经由细胞核因子κB（NF-κB）和 p38 促分裂原活化蛋白激酶途径[7]。上游途径是 ROS 还是 TGF-β1 可能与细胞的类型或其他因素相关，本研究未深入探讨。总之，目前的研究结果说明高糖上调 HO-1 表达至少部分是经过 ROS 或 TGF-β1/PI3K/Akt 信号途径。
综上所述，我们的研究发现高糖促进肺腺癌 A549 细胞 HO-1 表达增加，结合以往研究已经发现 HO-1 与肺癌的发展与转移密切的相关，因此可以推测高糖可能通过 HO-1 增加促进肺腺癌的进展， HO-1 可能是一个潜在的肺癌治疗靶点。
血红素加氧酶（heme oxygenase，HO）是一种微粒体酶，在人和哺乳动物体内广泛存在，参与多种生理和病理过程，是血红素代谢的起始酶和限速酶，在细胞抗氧化应激、炎症反应、增殖中起着重要作用。近年研究发现在多种肿瘤组织中 HO-1 表达增多，并已在人腺癌、前列腺癌、口腔鳞状细胞癌、食管癌、黑色素瘤和胰腺癌等多种实体肿瘤研究中得到证实[1–2]。研究发现高糖增加肿瘤细胞的侵袭能力如 MCF-7 乳腺癌细胞[3–4]、胰腺癌细胞[5]。而且 HO-1 与肿瘤细胞的淋巴结转移相关，与肺癌的进展相关[6]。非小细胞肺癌患者 HO-1 表达增多，有着更差的预后以及更高的转移发生率[7]。糖尿病患者 HO-1 的表达上调[8]，然而在糖尿病合并肺癌的人群中 HO-1 表达情况尚不清楚。因此在本实验中，我们在体外用高糖作用于肺腺癌上皮细胞系 A549 细胞，观察高糖对 HO-1 蛋白和 mRNA 的表达及 HO-1 活性的影响及其潜在机制，为肺癌合并糖尿病人群临床治疗提供新的靶点。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人 A549 细胞系（中科院上海细胞库），DMEM高糖培养基（Hyclone 公司），DMEM 低糖培养基（Hyclone 公司），胎牛血清 FBS（Gibco 公司），胰酶 TRYPSIN（Invitrogen 公司），2′, 7′-dichloro- dihydrofluorescin diacetate（DCFH-DA，Sigma），活性氧（ROS）抑制剂 N-乙酰半胱氨酸（NAC），人血红素加氧酶 1（HO-1）酶联免疫试剂盒，HO-1 引物；GAPDH 引物；高容量 cDNA 反转录试剂盒；SYBR Green PCR Master Mix（ABI Applied Biosystems 公司）。
1.2 实验方法和检测指标
1.2.1 细胞培养 从液氮罐中取出冻存管，迅速放入 37 ℃ 的水浴锅中复温。在离心管中，加入约 5 ml低糖培养液培养液，将冻存管中解冻后的悬液吸出，加入离心管内的培养液中，吹打几下，密封离心（1 000 r/min，5 min），弃上清，用 RPMI1640+10% FBS适当稀释后，移入培养瓶中，置于培养箱中，37 ℃ 5% CO2常规培养。细胞生长至 80% 融合时，用胰蛋白酶消化传代，继续培养。为研究 A549 细胞功能，选择第 3～15 代的 A549 细胞用于进一步实验操作。
1.2.2 Western blot 检测 HO-1 表达 Western blot 按照试剂盒说明进行，A549 细胞给予不同预处理后提取蛋白，然后测浓度、煮样，在10% 的凝胶上电泳，300 mA 转膜 50 min，在 5% 的脱脂牛奶中室温封闭 2 h，在 4 ℃ 摇床孵育过夜，然后洗膜扫膜。β-actin 为内参照。
1.2.3 逆转录 PCR 技术 为观察高糖等处理对 A549 细胞 HO-1 mRNA 表达水平的影响，进行 Real-time RT-PCR 的实验研究。提取 A549 细胞 RNA，根据 Applied Biosystems 高通量 cDNA Reverse Transcription Kit 操作步骤完成，并放置于逆转录系统（Eppendorf Mastercycler公司）中进行 cDNA 合成。参照 ABI Applied Biosystems 公司的 SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒操作步骤进行。将 cDNA 样本取出，用 Real-time PCR 实验进行定量分析。总量 20 μl的Real-time PCR 反应体系主要由10 μl SYBR Green PCR Master Mix（ABI Applied Biosystems公司），1 μl 上游引物，1 μl 下游引物，1 μl cDNA 模板和去离子水 7 μl，组成 20 μl 总体系。将混合好的溶液加入 96 孔板中（冰上操作），瞬时离心。Realtime PCR反应主要在 ABI Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 7500 Real-time PCR 系统运行此实验。反应条件为：95 ℃ 10 min 预变性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环。溶解曲线为：95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min。所用引物均由 Primer 5 设计软件进行设计。HO-1 基因的引物序列如下：HO-1 sense，5′-TTC TTC ACC TTC CCC AAC TA-3′；antisense，5′-GCA TAA AGC CCT ACA GCA AC-3′。
1.2.4 细胞 ROS 检测 通过检测 DCFH-DA 来检测细胞内 ROS 的含量。其基本原理是 DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由通过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解后形成不能通过细胞膜的 DCFH，从而使探针很容易被装载到细胞内，细胞内的 ROS 可以氧化无荧光的 DCFH 生成有荧光的 DCF，检测 DCF 的荧光间接判断细胞内活性氧的水平。将 A549 细胞根据实验要求进行分组，分组处理后的 A549 细胞用于 ROS 检测。用 PBS 轻轻的洗细胞 2 次，弃去 PBS，加入 10 μmol/L 的 DCFH-DA，避光 37 ℃，染色 45 min，然后用 PBS 清洗细胞，1 000g 离心。然后加入黑板内，在酶标仪下检测OD 值。
1.2.5 HO-1 活性及 TGF-β1 检测 A549 细胞给予不同预处理后，留取上清，用人 HO-1 酶联免疫试剂盒和 TGF-β1 试剂盒，按照说明书操作，酶标仪检测确定 HO-1 活性及高糖诱导细胞分泌 TGF-β1水平。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计分析软件，计量数据以均数±标准差（ ）表示。使用非配对t 检验进行统计。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 高糖增加 A549 细胞 HO-1 的表达
为了判断高糖对 A549 细胞 HO-1 表达的影响，采用 25 mmol/L 高糖分别处理 A549 细胞 0、24、48、72 h，然后提取蛋白和 RNA 进行实验。25 mmol/L高糖增加 A549 细胞 HO-1 表达并呈时间依赖性（图 1a和图 1c）。同时也给予0、10、25、40 mmol/L 浓度高糖处理 A549 细胞 48 h，结果显示高糖增加 A549细胞 HO-1 表达呈浓度依赖性（图 1b和图 1d）。为了排除渗透压的影响，用甘露醇 25 mmol/L 代替高糖处理细胞 48 h，结果显示甘露醇没有影响细胞 HO-1 的表达（图 2）。
图1
高糖对 HO-1 mRNA 和蛋白表达的影响
图2
甘露醇对 HO-1 蛋白表达的影响
2.2 高糖增加A549细胞HO-1的活性
用酶标仪通过检测胆红素的生成量确定 HO-1活性，高糖处理细胞 48 h 或过氧化氢（500 μmol/L）处理细胞 2 h 增加了 HO-1 的活性，而甘露醇没有增加 HO-1 活性，说明用抗氧化剂预处理细胞能够明显抑制高糖诱导 HO-1 活性的增加。结果见图 3。
图3
高糖和过氧化氢增加 A549 细胞 HO-1 酶活性
2.3 高糖诱导细胞 ROS 产生并介导 HO-1 表达
用 DCFH-DA 染色法检测高糖对细胞内 ROS 产生的影响。为了确定高糖是否能诱导细胞产生 ROS 以及 ROS 对 HO-1 表达的影响，分别用正常糖、高糖、高糖加 NAC 100 μmol/L、甘露醇处理 A549 细胞 48 h，用过氧化氢处理细胞 2 h。与对照组比较，高糖组细胞内 ROS 产生显著增多（图 4a）。甘露醇未能诱导细胞内ROS产生（图 4a）。如细胞预先用抗氧化剂 NAC 100 μmol/L 处理 30 min，然后给予高糖 25 mmol/L 作用于细胞 48 h，结果显示和高糖组相比，NAC 显著抑制细胞内 ROS 产生，并且显著减弱高糖诱导的 HO-1 表达（图 4c 和图 4d）。为了判断内源性氧化应激的角色，给予外源性过氧化氢 500 μmol/L 处理细胞 4 h，结果过氧化氢增加细胞内 ROS 产生（图4 a），并且增加细胞 HO-1 表达和 HO-1 酶活性（图 4b、图 4d 和图 3）。这些实验结果显示高糖增加细胞内 ROS 产生，并介导 HO-1 表达。
图4
高糖诱导细胞 ROS 产生并介导 HO-1 表达
2.4 PI3K/Akt 信号途径参与介导高糖诱导 HO-1表达
给予 PI3K 抑制剂（10 μmol/L）或 Akt 抑制剂（100 nmol/L）作用细胞 30 min，然后再给予高糖处理 48 h 或过氧化氢（500 μmol/L）2 h。结果显示 PI3K 抑制剂（10 μmol/L）或 Akt 抑制剂（100 nmol/L）均不同程度地抑制高糖诱导 HO-1 表达（图 5a），但 PI3K 抑制剂（10 μmol/L）或 Akt 抑制剂（100 nmol/L）没有抑制过氧化氢诱导 HO-1 表达（图5 b），提示 PI3K/Akt 信号途径参与高糖诱导 HO-1 表达，但不依赖于细胞内 ROS 产生。
图5
PI3K/Akt 信号途径在高糖诱导 HO-1 表达中的角色
2.5 高糖诱导 TGF-β1 产生并介导 HO-1 表达
用高糖处理细胞 48 h 后收集细胞液上清，然后用 TGF-β1 试剂盒检测 TGF-β1 的含量。结果显示与对照组比较，高糖增加 TGF-β1 的产生，然而甘露醇和过氧化氢没有诱导 TGF-β1 的产生（图 6a）。为了进一步证明 TGF-β1 在高糖诱导 HO-1 表达的角色，用 TGF-β1 2 ng/ml 作用于细胞，结果显示 TGF-β1诱导 A549 细胞 HO-1 表达增加，给予 PI3K 抑制剂（10 μmol/L）或 Akt 抑制剂（100 nmol/L）能够显著抑制 TGF-β1 诱导 HO-1 表达（图 6b）。这些实验结果表明 TGF-β1 经由 PI3K/Akt 信号途径参与高糖诱导 HO-1 表达。
图6
高糖诱导 TGF-β1 产生和 TGF-β1 在高糖诱导 HO-1 表达增加中的作用
3 讨论
流行病学资料显示糖尿病患者罹患各种恶性肿瘤的风险增加，如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和子宫内膜癌等，并且促进肿瘤发展和转移，这可能与糖尿病人群高水平的胰岛素和胰岛素样生长因子相关，也可能与糖尿病微血管病变使血管更容易被肿瘤细胞侵袭相关[8]。与其他器官一样，目前研究显示糖尿病也可促进肺癌的发生发展和转移，但糖尿病促进肺癌发展和转移的机制尚不明确。
HO-1 在一些代谢紊乱疾病中升高[9–11]。糖尿病患者血中 HO-1 水平升高与年龄、性别和体重指数无明显相关性，可能与一些特定器官损伤有关，如胰岛或胰腺 β 细胞损伤。本实验结果显示高糖增加 HO-1 蛋白和 RNA 表达，而且伴随 HO-1 表达的增加，同时 HO-1 的酶活性也增加，这一发现与视网膜内皮细胞的相关研究结果一致[12]。自发性糖尿病大鼠肝脏的 HO-1 表达水平较正常大鼠肝脏明显升高，提示在慢性高血糖状态下，HO-1 表达的升高可能参与了氧化性损伤的修复过程，高糖增加 HO-1表达的可能机制为高糖诱导 ROS 产生增加[13–14]。在 A549 细胞，正如在其他类型细胞一样[12,15]，ROS 能够促进 HO-1 表达上调[16]。本实验结果显示高糖诱导 ROS 产生，而抗氧化剂 NAC 能减少 ROS 的产生并且减弱高糖诱导 HO-1 的表达。本研究发现外源性 H2O2（500 μmol/L）可以增加 HO-1 的表达，这与在其他类型细胞相关研究结果一致[17–19]。
我们还发现 PI3K/Akt 信号途径在高糖诱导细胞 HO-1 表达中起重要作用。文献报道在其他类型细胞上 ROS 经 PI3K/Akt 信号途径诱导 HO-1 表达上调[21–22]，本研究发现 PI3K/Akt 信号途径的上游途径不是 ROS 而是 TGF-β1。高糖可诱导细胞产生TGF-β1[20]，而 TGF-β1 能够经由 PI3K/Akt 信号途径上调 HO-1 表达[7]，TGF-β1 还可经由细胞核因子κB（NF-κB）和 p38 促分裂原活化蛋白激酶途径[7]。上游途径是 ROS 还是 TGF-β1 可能与细胞的类型或其他因素相关，本研究未深入探讨。总之，目前的研究结果说明高糖上调 HO-1 表达至少部分是经过 ROS 或 TGF-β1/PI3K/Akt 信号途径。
综上所述，我们的研究发现高糖促进肺腺癌 A549 细胞 HO-1 表达增加，结合以往研究已经发现 HO-1 与肺癌的发展与转移密切的相关，因此可以推测高糖可能通过 HO-1 增加促进肺腺癌的进展， HO-1 可能是一个潜在的肺癌治疗靶点。
