引用本文： 李萌, 张令轩, 宋歌, 高福生. 虾青素对支气管哮喘大鼠气道炎症及气道重构的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(8): 575-582. doi: 10.7507/1671-6205.202309016 复制
支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的慢性呼吸系统疾病，其发病率呈逐年增高的趋势，全世界3亿多人患有哮喘，中国约有
AST即3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’胡萝卜素，是一种具有抗炎、抗氧化作用的脂溶性类胡萝卜素，在神经系统疾病等多种疾病的发生和发展中发挥重要作用[4-7]。近年来，氧化应激在支气管哮喘发生发展中的作用日益引起人们的重视。但到目前为止，AST对支气管哮喘气道炎症和气道重构的影响，国内外均少见报道。为此，我们用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏和激发建立大鼠支气管哮喘模型，并给予虾青素灌胃处理，观察AST对大鼠气道炎症及气道重构的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠50只（购自济南朋悦实验动物繁育有限公司），5～6周龄，平均体重140～180 g，清洁级，动物生产许可证号：SCXK（鲁）
1.1.2 主要仪器及试剂
包埋机（武汉俊杰电子有限公司），显微镜（尼康仪器有限公司），病理切片机（德国Leica公司），高速冷冻离心机（美国ThermoFisher公司），酶标仪（南京德铁实验设备有限公司），PCR仪（美国BIORAD公司），OVA干粉（上海麦克林生化科技有限公司），氢氧化铝（西陇科学股份有限公司），虾青素（Solarbio），4%多聚甲醛（biosharp），RNA提取试剂TRIzol（VICMED），1-溴-3-氯丙烷（上海麦克林生化科技有限公司），小鼠抗大鼠MUC5AC单抗（美国Neomarker公司），大鼠IL-5、IL-13、总IgE、TGF-β、MDA、SOD ELISA测定试剂盒（上海酶联生物），RT-PCR试剂盒（AG和TaKaRa），雾化器（boy037G6000型，德国Pari公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
50只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为5组（n=10）。生理盐水致敏+生理盐水激发组（对照组）：应用生理盐水致敏大鼠，生理盐水雾化吸入2周；支气管哮喘组（哮喘组）：OVA致敏大鼠和反复雾化吸入2周制备支气管哮喘大鼠模型；为了探讨虾青素处理是否有剂量依赖性，又将虾青素分为三组不同剂量组，支气管哮喘+虾青素5 mg/kg灌胃处理组（AST 5 mg/kg组）、支气管哮喘+虾青素10 mg/kg灌胃处理组（AST 10 mg/kg组）、支气管哮喘+虾青素50 mg/kg灌胃处理组（AST 50 mg/kg组）：三组支气管哮喘大鼠分别给予相应剂量的虾青素灌胃处理10 d。各组大鼠于末次OVA或生理盐水激发24 h后处死。
1.2.2 建立支气管哮喘模型
参考Palmans等[8]的方法建立大鼠支气管哮喘模型。于第1 d、第8 d用新鲜配置的OVA 1 mg+氢氧化铝100 mg+生理盐水1 ml混悬液，在大鼠两侧腹股沟、腹、前足趾，共4点做皮下注射，每点0.2 ml，腹腔注射0.2 ml。从第15 d至第29 d，连续2周，将大鼠放于自制有机玻璃箱（50 cm×27 cm×25 cm）内，连接雾化器，以1%OVA生理盐水溶液（1g OVA溶于100 ml 0.9%氯化钠）进行雾化吸入，每周3次，每次30 min。对照组以生理盐水代替OVA致敏和激发。
1.2.3 虾青素处理
按照Hwang等[9]的研究方法，在OVA激发前给予AST组每只大鼠2 ml虾青素生理盐水混悬液（含5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg虾青素）灌胃，从第15 d至第24 d，连续10 d；对照组和哮喘组用2 ml生理盐水进行灌胃处理。
1.2.4 肺组织的获取
各组大鼠在末次OVA或生理盐水激发24 h后，用5%水合氯醛将大鼠麻醉，剖开胸腔，心脏穿刺取血，
1.2.5 ELISA测定BALF IL-5、IL-13、IFN-γ、TGF-β、MDA、SOD及血清总IgE水平
–80 ℃冰箱取出BALF上清液，室温孵育20 min，操作步骤按ELISA试剂盒说明书进行。用酶标仪在450nm波长测定各孔累积光密度（integrated optical density，IOD）值。
1.2.6 大鼠肺组织切片HE染色
取出用4%多聚甲醛浸泡的肺组织，置于室温静置10 min，石蜡包埋固定后，切取５μｍ厚切片，在HE染色切片上随机选取直径500～
1.2.7 肺组织PAS染色
石蜡包埋肺组织，切片机切取5 μm 厚的肺组织切片，按照PAS染色试剂盒说明进行染色。在 PAS染色切片上，测量气道上皮表面与基底膜间区域的总面积及被PAS染成玫瑰红色的面积，以PAS染色面积占该区域总面积的百分比表示杯状细胞增生程度。
1.2.8 肺组织Masson染色
常规石蜡包埋、切片，按照Masson染色试剂盒说明进行染色。在Masson染色切片上，测量气道上皮基底膜下20 μm区域内被染成蓝色的非细胞部分的面积和该区域的总面积，以被染成蓝色部分的面积占该区域总面积的百分比表示上皮下胶原纤维沉积的程度。
1.2.9 大鼠肺组织中MUC5AC mRNA检测
–80 ℃冰箱取出肺组织，于液氮中研磨约30 mg，溶解到1 mL Trizol试剂中，依次加入1/5体积的1-溴-3-氯丙烷、异丙醇、80%乙醇（现用现配）后提取RNA，分别测定各组RNA 浓度，根据RNA 浓度加样，利用试剂盒说明进行逆转录得到互补DNA（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。MUC5AC mRNA上游引物：5’- GGGCAGCGCTACAGTTTCAG-3’，下游引物：5’-TCAGTGACAACACGAAAGGC-3’，扩增片段100碱基对（base pair，100bp）；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA上游引物：5’-TCCTGTGGCATCCATGAAACT-3’，下游引物：5’-GAAGCACTTGCGGTGCACGAT-3’，扩增片段185bp。根据RT-PCR试剂盒说明进行操作，10 μL体系进行定量 PCR，得到各组mRNA 表达水平及溶解曲线。将得到CT值，用2-ΔΔCT法求出数值，利用Prism 8软件作图并分析数据。
1.2.10 大鼠肺组织MUC5AC免疫组织化学染色
甲醛固定的右肺下叶石蜡包埋，制作5 μm组织切片，脱蜡入水，小鼠抗大鼠MUC5AC单抗，4 ℃孵育过夜，用PBS进行1∶200稀释一抗，用PBS进行1∶2 000稀释二抗，孵育1.5 h后，抗生物素蛋白链菌素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法染色，苏木精复染，以PBS代替一抗为阴性对照。每只大鼠直径在500～
1.3 统计学处理
数据以均数±标准差（x± s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），单因素方差分析后组间两两比较采用Tukey-Kramer检验。P<0.05为差异有统计学意义。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0进行。
2 结 果
2.1 各组大鼠BALF上清液细胞因子水平
哮喘组BALF上清液中IL-5、IL-13、TGF-β水平均高于对照组（P<0.01或P<0.001）；灌胃5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg AST后，BALF上清液中IL-5、IL-13、TGF-β水平进行性降低，呈剂量依赖性（P<0.05或P<0.01）；哮喘组IFN-γ水平低于对照组（P<0.001），AST灌胃处理后IFN-γ水平高于哮喘组（P<0.05或P<0.01），而AST灌胃处理的3组水平无差别（P>0.05）。结果见表1。
表1
各组大鼠BALF上清液中IL-5、IL-13的表达水平（x± s ，ng/mL，n=10）
2.2 各组大鼠BALF中氧化/抗氧化细胞因子水平
与对照组比较，哮喘组大鼠BALF中MDA水平升高，SOD水平降低（P<0.001）；与哮喘组比较，哮喘大鼠经5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg AST灌胃处理后，BALF中MDA水平降低，SOD水平升高（P<0.05或P<0.01）。结果见表2。
表2
各组大鼠BALF上清液中MDA、SOD的表达水平（x± s，n=10）
2.3 各组大鼠血清中总IgE水平
哮喘组大鼠血清总IgE水平高于对照组（P<0.001）；哮喘大鼠经5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg AST灌胃处理后，血清总IgE水平降低（P<0.05或P<0.01），三组均低于哮喘组；而AST组之间无差别（P>0.05）。结果见表3。
表3
各组大鼠血清总IgE水平（x± s ，ng/mL，n=10）
2.4 各组大鼠气道上皮炎症细胞浸润及上皮细胞脱落程度
与对照组比较，哮喘组大鼠气道可见炎症细胞浸润和散在的上皮细胞损伤脱落（P<0.001）；与哮喘组比较，AST灌胃处理后大鼠气道炎症细胞浸润、上皮细胞脱落程度减轻（P<0.01或P<0.001）；而AST不同剂量处理之间无差别（P>0.05）。结果见表4，图1。
表4
各组大鼠的气道炎症浸润和上皮细胞脱落程度（x± s，n=10）
图1
各组大鼠的气道炎症浸润和上皮细胞脱落病理学观察（HE ×400）
2.5 各组大鼠气道上皮杯状细胞增生程度
哮喘组大鼠气道上皮可见杯状细胞增生，对照组大鼠无气道上皮杯状细胞增生（P<0.001）；与哮喘组比较，AST灌胃处理组大鼠气道上皮杯状细胞数量减少（P<0.05或P<0.01或P<0.001）；而AST 不同剂量之间无显著差异（P>0.05）。结果见表5、图2。
表5
各组大鼠的气道上皮杯状细胞增生和上皮下胶原沉积程度（x± s，n=10）
图2
各组大鼠气道上皮杯状细胞增生病理学观察（PAS ×200 ）
2.6 各组大鼠气道上皮下胶原纤维沉积程度
哮喘组大鼠气道上皮下有胶原纤维沉积，对照组大鼠气道上皮下未见有胶原纤维沉积（P<0.001）；与哮喘组比较，AST灌胃处理后气道上皮下胶原纤维沉积程度减轻（P<0.01或P<0.001）；而AST 处理组之间气道上皮下胶原纤维沉积程度无差异（P>0.05）。结果见表5、图3。
图3
各组大鼠气道上皮下胶原纤维沉积病理学观察（Masson ×200）
2.7 各组大鼠肺组织MUC5AC mRNA的表达
哮喘组大鼠肺组织中MUC5AC mRNA表达比对照组显著升高（P<0.001）；与哮喘组比较，AST灌胃处理组MUC5AC mRNA表达降低（P<0.01）；而AST灌胃处理组之间MUC5AC mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。结果图4。
图4
各组大鼠肺组织的MUC5AC mRNA表达水平（n =10，x± s）
注：与对照组比较，***
2.8 各组大鼠气道上皮MUC5AC的表达
与对照组比较，哮喘组大鼠的气道上皮MUC5AC蛋白表达水平升高（P<0.001）；AST处理组与哮喘组比较，大鼠气道周围MUC5AC蛋白表达水平降低（P<0.01）；不同剂量AST处理组MUC5AC表达无差异（P>0.05）结果见表6、图5。
表6
各组大鼠肺组织MUC5AC的表达（x± s）
图5
各组大鼠气道上皮细胞MUC5AC的表达（SABC ×200）
3 讨论
氧化应激是指活性氧产生能力与抗氧化防御能力之间的失衡，这种失衡与哮喘气道慢性炎症有关[10]。研究表明[11]，哮喘患者血浆氧化应激标志物MDA、高级氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products，AOPP）含量升高，SOD活性降低，抗氧化剂谷胱甘肽（glutathione，r-glutamyl cysteingl+glycine，GSH）水平降低，GSH的消耗可能与抑制辅助性T细胞1型（t-helper cell 1，Th1）相关细胞因子和促进辅助性T细胞2型（t-helper cell 2，Th2）相关细胞因子的产生有关，提示氧化应激在哮喘的发生和发展中具有重要作用。
AST是一种天然的抗氧化剂，其主要机制是通过抑制细胞因子和趋化因子活性调节免疫反应，大量证据支持AST对心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、癌症和肥胖引起的氧化损伤有一定保护作用[12]。尽管目前导致哮喘的分子机制尚不清楚，但氧化和炎症介质被发现在这一过程中扮演了重要角色。为此，本研究通过分析虾青素对哮喘大鼠的影响，初步阐明其发挥抗炎作用的潜在机制。
聚集在气道上皮炎症细胞会产生大量活性氧，而活性氧刺激组胺释放，导致内皮细胞损伤脱落，破坏β-肾上腺素能受体的功能，从而加重气道炎症和重构。MDA的表达反映了全身脂质过氧化的程度，通常与SOD的测定相结合。SOD是一种重要的抗氧化酶和氧化应激标志物，在清除自由基、防止细胞损伤、促进氧化和抗氧化平衡等方面发挥着重要作用，SOD的活性可反应氧自由基对肺损伤的程度[13]。本研究表明虾青素可以降低哮喘大鼠肺组织中MDA的含量，升高SOD的活性，说明虾青素可以调节哮喘大鼠的氧化应激水平。
支气管哮喘是由多种炎性细胞如T淋巴细胞、 巨噬细胞等和细胞组分共同参与介导的气道慢性炎症性疾病[14]。当外源性变应原进入机体后，被抗原提呈细胞内吞并将过敏原呈递给Th2细胞，活化的Th2细胞产生IL-4、IL-5、 IL-13等细胞因子[15]，这些细胞因子在哮喘气道炎症和重构中起重要的调控作用，而具有促纤维化活性的TGF-β与气道重构密切相关[16]。其中，IL-4、 IL-13可激活B淋巴细胞合成特异性IgE，抗原与抗体结合后激活肥大细胞、嗜碱性粒细胞等炎症细胞并使其释放多种活性物质。IL-5诱导嗜酸性粒细胞在气道上皮内聚集、活化和成熟，导致嗜酸性粒细胞炎症[17]，抗IL-5治疗是治疗高嗜酸性粒细胞综合征患者的有效方法之一。IL-13主要是由CD4+Th2 细胞产生，活化的单核细胞、B细胞、CD8+细胞等在一定条件下也能分泌IL-13[18]。作为主要的Th2细胞因子之一，IL-13在哮喘等变应性疾病中发挥重要调控作用，IL-4和IL-13可以通过IL-4受体上调黏蛋白的表达，是促进杯状细胞增生、组织重构和支气管痉挛的主要细胞因子[19]。IL-13可促进哮喘气道炎症、黏液过度分泌、气道高反应性（airway hyper reactivity，AHR）和IgE的合成[20]。Th1细胞分泌的IFN-γ在Th1分化中起重要作用，IFN-γ主要通过抑制CD4+ T细胞的浸润、减少Th2细胞因子（IL-4和IL-5）的产生、抑制IgE的合成，减轻过敏性气道炎症抑制嗜酸性粒细胞的聚集[21-22]。本研究表明虾青素可以降低哮喘大鼠肺组织中IL-5、IL-13和IgE水平，提高IFN-γ水平，说明虾青素可以减轻哮喘大鼠的气道炎症。
气道重构是哮喘的重要病理特征，包括上皮细胞脱落、杯状细胞增生、上皮下胶原蛋白沉积和纤维化、新生血管生成、气道平滑肌细胞肥大和增生等病理改变[23]。在呼吸道黏膜表面覆盖着由杯状细胞和黏膜下腺体分泌的黏液，其中杯状细胞是主要的分泌细胞[24]，其分泌的黏液是由水、离子、蛋白、糖蛋白及脂质等组成的混合物。黏液的主要成分是黏蛋白，对气道的局部防御至关重要[25]。在哮喘患者和哮喘动物模型中气道黏液的过度分泌是主要的病理学特征之一[26]。过度分泌的黏液可以阻塞气道，使气道阻力增加，加重气道高反应性，是哮喘患者发病和死亡的主要原因之一[27]。哮喘患者气道分泌的黏蛋白主要是MUC5AC，主要由气道上皮杯状细胞分泌。研究发现，IL-13可促进杯状细胞增生，上调MUC5AC的表达[28]。Khalfaoui等[29]发现哮喘患者气道上皮组织样本中MUC5AC表达量显著高于对照组。Siddiqui等发现[28]，miR-141可调节IL-13，促进气道上皮杯状细胞增生，MUC5AC基因和蛋白表达，促进气道重塑。而miR-145可抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的激活，下调MUC5AC表达，减轻气道重构[30]。本实验中，经过AST处理， IL-13水平降低，同时气道MUC5AC表达降低，提示两者有一定相关性，IL-13在上调MUC5AC中起一定作用，AST可下调哮喘大鼠肺中MUC5AC的表达，抑制杯状细胞增生，减少气道黏液分泌，降低气道周围胶原纤维的沉积，减轻气道重构。
Hwang等[9]通过动物实验证明，AST可抑制OVA诱导的哮喘小鼠肺部炎症细胞的浸润、黏液的过度分泌和肺纤维化。在本研究中，我们也得到了同样的结果。综合以上，我们初步判断AST可通过缓解氧化应激水平，减轻OVA诱导的哮喘大鼠气道炎症，可能与抑制Th2细胞因子（IL-5和IL-13）的释放，调节Th1/Th2失衡，降低血清IgE水平有关。AST还可下调MUC5AC表达，抑制杯状细胞增生，减少气道黏液高分泌，降低气道周围胶原纤维的沉积，减轻气道重构。此外，为了探讨三组不同剂量的AST处理组之间有无差异，经过研究发现，不同剂量AST处理对哮喘大鼠气道炎症及气道重构无剂量依赖性，提示小剂量的AST对哮喘气道炎症和气道重构起一定保护作用。因此，抗氧化治疗可能是未来支气管哮喘防治的有效靶点之一，其确切的机制还有待于进一步研究。
本实验还存在一定的局限性。首先，可逆性气流受限及气道高反应是哮喘的一个重要病理特征，但由于实验条件的限制，我们在评估虾青素治疗效果时无法对该参数进行评价。其次我们还需要使用分子特异性抑制剂来充分阐明其信号机制。其次，在分组方面我们可以再设立一组激素组，观察虾青素与激素联合应用的治疗效果与单用虾青素的治疗效果如何。最后，虾青素作为治疗剂的安全性需要进一步的测试。我们的研究为支气管哮喘的发病机制带来了新的视角，虾青素在哮喘中的作用可能为今后哮喘的预防和治疗提供新的靶点，为将来进一步的机制研究做一定基础参考。
支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的慢性呼吸系统疾病，其发病率呈逐年增高的趋势，全世界3亿多人患有哮喘，中国约有
AST即3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’胡萝卜素，是一种具有抗炎、抗氧化作用的脂溶性类胡萝卜素，在神经系统疾病等多种疾病的发生和发展中发挥重要作用[4-7]。近年来，氧化应激在支气管哮喘发生发展中的作用日益引起人们的重视。但到目前为止，AST对支气管哮喘气道炎症和气道重构的影响，国内外均少见报道。为此，我们用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏和激发建立大鼠支气管哮喘模型，并给予虾青素灌胃处理，观察AST对大鼠气道炎症及气道重构的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠50只（购自济南朋悦实验动物繁育有限公司），5～6周龄，平均体重140～180 g，清洁级，动物生产许可证号：SCXK（鲁）
1.1.2 主要仪器及试剂
包埋机（武汉俊杰电子有限公司），显微镜（尼康仪器有限公司），病理切片机（德国Leica公司），高速冷冻离心机（美国ThermoFisher公司），酶标仪（南京德铁实验设备有限公司），PCR仪（美国BIORAD公司），OVA干粉（上海麦克林生化科技有限公司），氢氧化铝（西陇科学股份有限公司），虾青素（Solarbio），4%多聚甲醛（biosharp），RNA提取试剂TRIzol（VICMED），1-溴-3-氯丙烷（上海麦克林生化科技有限公司），小鼠抗大鼠MUC5AC单抗（美国Neomarker公司），大鼠IL-5、IL-13、总IgE、TGF-β、MDA、SOD ELISA测定试剂盒（上海酶联生物），RT-PCR试剂盒（AG和TaKaRa），雾化器（boy037G6000型，德国Pari公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
50只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为5组（n=10）。生理盐水致敏+生理盐水激发组（对照组）：应用生理盐水致敏大鼠，生理盐水雾化吸入2周；支气管哮喘组（哮喘组）：OVA致敏大鼠和反复雾化吸入2周制备支气管哮喘大鼠模型；为了探讨虾青素处理是否有剂量依赖性，又将虾青素分为三组不同剂量组，支气管哮喘+虾青素5 mg/kg灌胃处理组（AST 5 mg/kg组）、支气管哮喘+虾青素10 mg/kg灌胃处理组（AST 10 mg/kg组）、支气管哮喘+虾青素50 mg/kg灌胃处理组（AST 50 mg/kg组）：三组支气管哮喘大鼠分别给予相应剂量的虾青素灌胃处理10 d。各组大鼠于末次OVA或生理盐水激发24 h后处死。
1.2.2 建立支气管哮喘模型
参考Palmans等[8]的方法建立大鼠支气管哮喘模型。于第1 d、第8 d用新鲜配置的OVA 1 mg+氢氧化铝100 mg+生理盐水1 ml混悬液，在大鼠两侧腹股沟、腹、前足趾，共4点做皮下注射，每点0.2 ml，腹腔注射0.2 ml。从第15 d至第29 d，连续2周，将大鼠放于自制有机玻璃箱（50 cm×27 cm×25 cm）内，连接雾化器，以1%OVA生理盐水溶液（1g OVA溶于100 ml 0.9%氯化钠）进行雾化吸入，每周3次，每次30 min。对照组以生理盐水代替OVA致敏和激发。
1.2.3 虾青素处理
按照Hwang等[9]的研究方法，在OVA激发前给予AST组每只大鼠2 ml虾青素生理盐水混悬液（含5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg虾青素）灌胃，从第15 d至第24 d，连续10 d；对照组和哮喘组用2 ml生理盐水进行灌胃处理。
1.2.4 肺组织的获取
各组大鼠在末次OVA或生理盐水激发24 h后，用5%水合氯醛将大鼠麻醉，剖开胸腔，心脏穿刺取血，
1.2.5 ELISA测定BALF IL-5、IL-13、IFN-γ、TGF-β、MDA、SOD及血清总IgE水平
–80 ℃冰箱取出BALF上清液，室温孵育20 min，操作步骤按ELISA试剂盒说明书进行。用酶标仪在450nm波长测定各孔累积光密度（integrated optical density，IOD）值。
1.2.6 大鼠肺组织切片HE染色
取出用4%多聚甲醛浸泡的肺组织，置于室温静置10 min，石蜡包埋固定后，切取５μｍ厚切片，在HE染色切片上随机选取直径500～
1.2.7 肺组织PAS染色
石蜡包埋肺组织，切片机切取5 μm 厚的肺组织切片，按照PAS染色试剂盒说明进行染色。在 PAS染色切片上，测量气道上皮表面与基底膜间区域的总面积及被PAS染成玫瑰红色的面积，以PAS染色面积占该区域总面积的百分比表示杯状细胞增生程度。
1.2.8 肺组织Masson染色
常规石蜡包埋、切片，按照Masson染色试剂盒说明进行染色。在Masson染色切片上，测量气道上皮基底膜下20 μm区域内被染成蓝色的非细胞部分的面积和该区域的总面积，以被染成蓝色部分的面积占该区域总面积的百分比表示上皮下胶原纤维沉积的程度。
1.2.9 大鼠肺组织中MUC5AC mRNA检测
–80 ℃冰箱取出肺组织，于液氮中研磨约30 mg，溶解到1 mL Trizol试剂中，依次加入1/5体积的1-溴-3-氯丙烷、异丙醇、80%乙醇（现用现配）后提取RNA，分别测定各组RNA 浓度，根据RNA 浓度加样，利用试剂盒说明进行逆转录得到互补DNA（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。MUC5AC mRNA上游引物：5’- GGGCAGCGCTACAGTTTCAG-3’，下游引物：5’-TCAGTGACAACACGAAAGGC-3’，扩增片段100碱基对（base pair，100bp）；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA上游引物：5’-TCCTGTGGCATCCATGAAACT-3’，下游引物：5’-GAAGCACTTGCGGTGCACGAT-3’，扩增片段185bp。根据RT-PCR试剂盒说明进行操作，10 μL体系进行定量 PCR，得到各组mRNA 表达水平及溶解曲线。将得到CT值，用2-ΔΔCT法求出数值，利用Prism 8软件作图并分析数据。
1.2.10 大鼠肺组织MUC5AC免疫组织化学染色
甲醛固定的右肺下叶石蜡包埋，制作5 μm组织切片，脱蜡入水，小鼠抗大鼠MUC5AC单抗，4 ℃孵育过夜，用PBS进行1∶200稀释一抗，用PBS进行1∶2 000稀释二抗，孵育1.5 h后，抗生物素蛋白链菌素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法染色，苏木精复染，以PBS代替一抗为阴性对照。每只大鼠直径在500～
1.3 统计学处理
数据以均数±标准差（x± s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），单因素方差分析后组间两两比较采用Tukey-Kramer检验。P<0.05为差异有统计学意义。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0进行。
2 结 果
2.1 各组大鼠BALF上清液细胞因子水平
哮喘组BALF上清液中IL-5、IL-13、TGF-β水平均高于对照组（P<0.01或P<0.001）；灌胃5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg AST后，BALF上清液中IL-5、IL-13、TGF-β水平进行性降低，呈剂量依赖性（P<0.05或P<0.01）；哮喘组IFN-γ水平低于对照组（P<0.001），AST灌胃处理后IFN-γ水平高于哮喘组（P<0.05或P<0.01），而AST灌胃处理的3组水平无差别（P>0.05）。结果见表1。
表1
各组大鼠BALF上清液中IL-5、IL-13的表达水平（x± s ，ng/mL，n=10）
2.2 各组大鼠BALF中氧化/抗氧化细胞因子水平
与对照组比较，哮喘组大鼠BALF中MDA水平升高，SOD水平降低（P<0.001）；与哮喘组比较，哮喘大鼠经5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg AST灌胃处理后，BALF中MDA水平降低，SOD水平升高（P<0.05或P<0.01）。结果见表2。
表2
各组大鼠BALF上清液中MDA、SOD的表达水平（x± s，n=10）
2.3 各组大鼠血清中总IgE水平
哮喘组大鼠血清总IgE水平高于对照组（P<0.001）；哮喘大鼠经5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg AST灌胃处理后，血清总IgE水平降低（P<0.05或P<0.01），三组均低于哮喘组；而AST组之间无差别（P>0.05）。结果见表3。
表3
各组大鼠血清总IgE水平（x± s ，ng/mL，n=10）
2.4 各组大鼠气道上皮炎症细胞浸润及上皮细胞脱落程度
与对照组比较，哮喘组大鼠气道可见炎症细胞浸润和散在的上皮细胞损伤脱落（P<0.001）；与哮喘组比较，AST灌胃处理后大鼠气道炎症细胞浸润、上皮细胞脱落程度减轻（P<0.01或P<0.001）；而AST不同剂量处理之间无差别（P>0.05）。结果见表4，图1。
表4
各组大鼠的气道炎症浸润和上皮细胞脱落程度（x± s，n=10）
图1
各组大鼠的气道炎症浸润和上皮细胞脱落病理学观察（HE ×400）
2.5 各组大鼠气道上皮杯状细胞增生程度
哮喘组大鼠气道上皮可见杯状细胞增生，对照组大鼠无气道上皮杯状细胞增生（P<0.001）；与哮喘组比较，AST灌胃处理组大鼠气道上皮杯状细胞数量减少（P<0.05或P<0.01或P<0.001）；而AST 不同剂量之间无显著差异（P>0.05）。结果见表5、图2。
表5
各组大鼠的气道上皮杯状细胞增生和上皮下胶原沉积程度（x± s，n=10）
图2
各组大鼠气道上皮杯状细胞增生病理学观察（PAS ×200 ）
2.6 各组大鼠气道上皮下胶原纤维沉积程度
哮喘组大鼠气道上皮下有胶原纤维沉积，对照组大鼠气道上皮下未见有胶原纤维沉积（P<0.001）；与哮喘组比较，AST灌胃处理后气道上皮下胶原纤维沉积程度减轻（P<0.01或P<0.001）；而AST 处理组之间气道上皮下胶原纤维沉积程度无差异（P>0.05）。结果见表5、图3。
图3
各组大鼠气道上皮下胶原纤维沉积病理学观察（Masson ×200）
2.7 各组大鼠肺组织MUC5AC mRNA的表达
哮喘组大鼠肺组织中MUC5AC mRNA表达比对照组显著升高（P<0.001）；与哮喘组比较，AST灌胃处理组MUC5AC mRNA表达降低（P<0.01）；而AST灌胃处理组之间MUC5AC mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。结果图4。
图4
各组大鼠肺组织的MUC5AC mRNA表达水平（n =10，x± s）
注：与对照组比较，***
2.8 各组大鼠气道上皮MUC5AC的表达
与对照组比较，哮喘组大鼠的气道上皮MUC5AC蛋白表达水平升高（P<0.001）；AST处理组与哮喘组比较，大鼠气道周围MUC5AC蛋白表达水平降低（P<0.01）；不同剂量AST处理组MUC5AC表达无差异（P>0.05）结果见表6、图5。
表6
各组大鼠肺组织MUC5AC的表达（x± s）
图5
各组大鼠气道上皮细胞MUC5AC的表达（SABC ×200）
3 讨论
氧化应激是指活性氧产生能力与抗氧化防御能力之间的失衡，这种失衡与哮喘气道慢性炎症有关[10]。研究表明[11]，哮喘患者血浆氧化应激标志物MDA、高级氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products，AOPP）含量升高，SOD活性降低，抗氧化剂谷胱甘肽（glutathione，r-glutamyl cysteingl+glycine，GSH）水平降低，GSH的消耗可能与抑制辅助性T细胞1型（t-helper cell 1，Th1）相关细胞因子和促进辅助性T细胞2型（t-helper cell 2，Th2）相关细胞因子的产生有关，提示氧化应激在哮喘的发生和发展中具有重要作用。
AST是一种天然的抗氧化剂，其主要机制是通过抑制细胞因子和趋化因子活性调节免疫反应，大量证据支持AST对心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、癌症和肥胖引起的氧化损伤有一定保护作用[12]。尽管目前导致哮喘的分子机制尚不清楚，但氧化和炎症介质被发现在这一过程中扮演了重要角色。为此，本研究通过分析虾青素对哮喘大鼠的影响，初步阐明其发挥抗炎作用的潜在机制。
聚集在气道上皮炎症细胞会产生大量活性氧，而活性氧刺激组胺释放，导致内皮细胞损伤脱落，破坏β-肾上腺素能受体的功能，从而加重气道炎症和重构。MDA的表达反映了全身脂质过氧化的程度，通常与SOD的测定相结合。SOD是一种重要的抗氧化酶和氧化应激标志物，在清除自由基、防止细胞损伤、促进氧化和抗氧化平衡等方面发挥着重要作用，SOD的活性可反应氧自由基对肺损伤的程度[13]。本研究表明虾青素可以降低哮喘大鼠肺组织中MDA的含量，升高SOD的活性，说明虾青素可以调节哮喘大鼠的氧化应激水平。
支气管哮喘是由多种炎性细胞如T淋巴细胞、 巨噬细胞等和细胞组分共同参与介导的气道慢性炎症性疾病[14]。当外源性变应原进入机体后，被抗原提呈细胞内吞并将过敏原呈递给Th2细胞，活化的Th2细胞产生IL-4、IL-5、 IL-13等细胞因子[15]，这些细胞因子在哮喘气道炎症和重构中起重要的调控作用，而具有促纤维化活性的TGF-β与气道重构密切相关[16]。其中，IL-4、 IL-13可激活B淋巴细胞合成特异性IgE，抗原与抗体结合后激活肥大细胞、嗜碱性粒细胞等炎症细胞并使其释放多种活性物质。IL-5诱导嗜酸性粒细胞在气道上皮内聚集、活化和成熟，导致嗜酸性粒细胞炎症[17]，抗IL-5治疗是治疗高嗜酸性粒细胞综合征患者的有效方法之一。IL-13主要是由CD4+Th2 细胞产生，活化的单核细胞、B细胞、CD8+细胞等在一定条件下也能分泌IL-13[18]。作为主要的Th2细胞因子之一，IL-13在哮喘等变应性疾病中发挥重要调控作用，IL-4和IL-13可以通过IL-4受体上调黏蛋白的表达，是促进杯状细胞增生、组织重构和支气管痉挛的主要细胞因子[19]。IL-13可促进哮喘气道炎症、黏液过度分泌、气道高反应性（airway hyper reactivity，AHR）和IgE的合成[20]。Th1细胞分泌的IFN-γ在Th1分化中起重要作用，IFN-γ主要通过抑制CD4+ T细胞的浸润、减少Th2细胞因子（IL-4和IL-5）的产生、抑制IgE的合成，减轻过敏性气道炎症抑制嗜酸性粒细胞的聚集[21-22]。本研究表明虾青素可以降低哮喘大鼠肺组织中IL-5、IL-13和IgE水平，提高IFN-γ水平，说明虾青素可以减轻哮喘大鼠的气道炎症。
气道重构是哮喘的重要病理特征，包括上皮细胞脱落、杯状细胞增生、上皮下胶原蛋白沉积和纤维化、新生血管生成、气道平滑肌细胞肥大和增生等病理改变[23]。在呼吸道黏膜表面覆盖着由杯状细胞和黏膜下腺体分泌的黏液，其中杯状细胞是主要的分泌细胞[24]，其分泌的黏液是由水、离子、蛋白、糖蛋白及脂质等组成的混合物。黏液的主要成分是黏蛋白，对气道的局部防御至关重要[25]。在哮喘患者和哮喘动物模型中气道黏液的过度分泌是主要的病理学特征之一[26]。过度分泌的黏液可以阻塞气道，使气道阻力增加，加重气道高反应性，是哮喘患者发病和死亡的主要原因之一[27]。哮喘患者气道分泌的黏蛋白主要是MUC5AC，主要由气道上皮杯状细胞分泌。研究发现，IL-13可促进杯状细胞增生，上调MUC5AC的表达[28]。Khalfaoui等[29]发现哮喘患者气道上皮组织样本中MUC5AC表达量显著高于对照组。Siddiqui等发现[28]，miR-141可调节IL-13，促进气道上皮杯状细胞增生，MUC5AC基因和蛋白表达，促进气道重塑。而miR-145可抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的激活，下调MUC5AC表达，减轻气道重构[30]。本实验中，经过AST处理， IL-13水平降低，同时气道MUC5AC表达降低，提示两者有一定相关性，IL-13在上调MUC5AC中起一定作用，AST可下调哮喘大鼠肺中MUC5AC的表达，抑制杯状细胞增生，减少气道黏液分泌，降低气道周围胶原纤维的沉积，减轻气道重构。
Hwang等[9]通过动物实验证明，AST可抑制OVA诱导的哮喘小鼠肺部炎症细胞的浸润、黏液的过度分泌和肺纤维化。在本研究中，我们也得到了同样的结果。综合以上，我们初步判断AST可通过缓解氧化应激水平，减轻OVA诱导的哮喘大鼠气道炎症，可能与抑制Th2细胞因子（IL-5和IL-13）的释放，调节Th1/Th2失衡，降低血清IgE水平有关。AST还可下调MUC5AC表达，抑制杯状细胞增生，减少气道黏液高分泌，降低气道周围胶原纤维的沉积，减轻气道重构。此外，为了探讨三组不同剂量的AST处理组之间有无差异，经过研究发现，不同剂量AST处理对哮喘大鼠气道炎症及气道重构无剂量依赖性，提示小剂量的AST对哮喘气道炎症和气道重构起一定保护作用。因此，抗氧化治疗可能是未来支气管哮喘防治的有效靶点之一，其确切的机制还有待于进一步研究。
本实验还存在一定的局限性。首先，可逆性气流受限及气道高反应是哮喘的一个重要病理特征，但由于实验条件的限制，我们在评估虾青素治疗效果时无法对该参数进行评价。其次我们还需要使用分子特异性抑制剂来充分阐明其信号机制。其次，在分组方面我们可以再设立一组激素组，观察虾青素与激素联合应用的治疗效果与单用虾青素的治疗效果如何。最后，虾青素作为治疗剂的安全性需要进一步的测试。我们的研究为支气管哮喘的发病机制带来了新的视角，虾青素在哮喘中的作用可能为今后哮喘的预防和治疗提供新的靶点，为将来进一步的机制研究做一定基础参考。
