目的 綜述國(guó)內(nèi)外應(yīng)用神經(jīng)肌肉電刺激(neuromuscular electrical stimulation,NMES)治療周圍神經(jīng)損傷的機(jī)制、參數(shù)選擇、臨床應(yīng)用等研究進(jìn)展。 方法 檢索近年來(lái)NMES 治療周圍神經(jīng)損傷的國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),綜述分析相關(guān)研究進(jìn)展。 結(jié)果 NMES 治療周圍神經(jīng)損傷應(yīng)在個(gè)體化參數(shù)、合適刺激方式下早期應(yīng)用,具有促進(jìn)神經(jīng)再生、預(yù)防肌肉萎縮的作用。 結(jié)論 NMES 臨床應(yīng)用安全、有效,植入式電刺激有望成為治療神經(jīng)斷裂傷的較佳選擇。
目的 研究灌注式生物反應(yīng)器中流體剪切力和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)在大段組織工程骨構(gòu)建過(guò)程中的作用。 方 法 抽取健康志愿者髂嵴處骨髓20 mL,分離、培養(yǎng)hBMSCs。將第3 代hBMSCs 與大段β-TCP 支架復(fù)合后,在灌注式生物反應(yīng)器中灌注培養(yǎng)28 d。灌注過(guò)程中,通過(guò)改變培養(yǎng)基黏度或灌流量,對(duì)接種在支架上的hBMSCs 施加不同流體剪切力(1、2、3 倍)或給予不同速率(3、6、9 mL/min)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。培養(yǎng)結(jié)束后,對(duì)接種在支架上的細(xì)胞行增殖及ALP 活性檢測(cè),同時(shí)對(duì)細(xì)胞/ 支架復(fù)合體進(jìn)行組織學(xué)觀察及形態(tài)學(xué)計(jì)量。 結(jié)果 灌流量均為3 mL/min 時(shí),流體剪切力2 倍組的細(xì)胞活性高于其他各組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);當(dāng)流體剪切力均為3 倍時(shí),3、6、9 mL/min 灌流量組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。當(dāng)灌流量均為3 mL/min 時(shí),流體剪切力2 倍組和3 倍組的ALP 活性高于1 倍組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);當(dāng)流體剪切力均為3 倍時(shí),灌流量為6 mL/min 組的ALP 活性最高(Plt; 0.05)。灌注培養(yǎng)28 d 后,各組ECM 分布于整個(gè)β-TCP 支架內(nèi),灌流量均為3 mL/min 時(shí),增加流體剪切力有利于支架內(nèi)ECM 形成及礦化;當(dāng)流體剪切力均為3 倍時(shí),增加灌流量使ECM 的礦化減少。 結(jié)論 流體剪切力和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)兩個(gè)流體動(dòng)力學(xué)參數(shù)是影響大段組織工程骨構(gòu)建的重要因素。在構(gòu)建大段組織工程骨過(guò)程中,應(yīng)調(diào)節(jié)流體動(dòng)力學(xué)參數(shù)使其對(duì)組織工程骨的構(gòu)建發(fā)揮最佳效應(yīng)。
目的 觀察重組人骨形成蛋白2(recombined human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2)異位誘導(dǎo)成骨過(guò)程中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)及其高親和力受體(tyrosine kinase receptor A, TrkA)的表達(dá),探討NGF在BMP骨誘導(dǎo)中的作用。 方法 ICR小鼠36只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組18只,均制備右側(cè)股后部肌袋異位成骨模型。實(shí)驗(yàn)組植入含rhBMP2膠原復(fù)合物,對(duì)照組僅植入相同體積的膠原海綿。分別于術(shù)后7、14和21 d取材,行大體、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察及RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果 大體觀察實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7 d,右股后部可捫及較硬腫塊;術(shù)后14、21 d,腫塊硬度增加。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)腫塊。組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組中rhBMP2膠原復(fù)合物具有良好的誘導(dǎo)成骨能力,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示骨誘導(dǎo)材料植入后7 d,NGF于成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肥大軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中均有陽(yáng)性表達(dá);14 d,NGF陽(yáng)性表達(dá)局限于部分成骨細(xì)胞、幼稚骨細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞,同時(shí)在骨髓中單核巨噬細(xì)胞、多核巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞中有明顯表達(dá);21 d,只有少量成骨樣細(xì)胞和破骨細(xì)胞以及骨髓中多核巨噬細(xì)胞有NGF表達(dá);TrkA免疫組織化學(xué)染色與NGF的表達(dá)基本一致。對(duì)照組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)成骨現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組NGF mRNA的 RT-PCR檢測(cè)顯示,術(shù)后7 d NGF的mRNA表達(dá)最高,14 d表達(dá)下降,21 d只有微量表達(dá)。結(jié)論 rhBMP-2復(fù)合物是一種有效的誘導(dǎo)成骨材料。在外源性BMP誘導(dǎo)成骨過(guò)程中有明顯的NGF及其高親和力受體TrkA的表達(dá),NGF可以通過(guò)直接和間接的方式參與BMP的誘導(dǎo)成骨過(guò)程。
目的 利用外源性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 immuno globlin,CTLA4Ig) 阻斷T細(xì)胞反應(yīng)的第2信號(hào),誘導(dǎo)新鮮同種異體骨移植免疫耐受。方法 采用近交系小鼠BALB/C 66只作為骨移植的受體,進(jìn)行異位肌袋一次及第2次骨移植。一次移植分為3組,每組18只,一組移植C57BL/6小鼠骨骼,注射L6(對(duì)照品),為AL組;一組移植C57BL/6小鼠骨骼,注射CTLA4-Ig,為AC組;一組移植同系BALB/C小鼠骨骼,注射PBS緩沖液,為AB組。在第2、4及6周,進(jìn)行血淋巴細(xì)胞亞群分析,血清抗體測(cè)定,供體細(xì)胞及抗原二次刺激實(shí)驗(yàn)及組織學(xué)觀察。另取12只BALB/C小鼠,進(jìn)行第2次移植實(shí)驗(yàn),供體為C57BL/6小鼠的骨骼,注射CTLA4-Ig后2周,分別移植C57BL/6(BC組)和C3H(BH組)小鼠的骨骼,檢測(cè)產(chǎn)生免疫耐受的特異性。結(jié)果 AL組與AB組比較,產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng),移植后2、4及6周,CD4 T細(xì)胞的增殖明顯增加(Plt;0.05),血清抗體明顯增多(Plt;0.05),供體細(xì)胞及骨抗原二次刺激的細(xì)胞增殖也明顯增加(Plt;0.05);AC組免疫排斥反應(yīng)較輕,在CD4 T細(xì)胞的增殖、血清抗體及二次刺激的細(xì)胞增殖方面均與AB組相似(Pgt;0.05);組織學(xué)觀察也顯示,異體骨周圍的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)消失,軟骨誘導(dǎo)及新骨形成,并出現(xiàn)幼稚的骨髓腔,與AB組相似。第2次移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BC組無(wú)論在CD4亞群增殖還是二次刺激增殖方面均明顯低于BH組,免疫耐受具有供體特異性。結(jié)論 在6周內(nèi)CTLA4-Ig誘導(dǎo)了小鼠新鮮同種異體骨移植免疫耐受,這為解決骨移植免疫反應(yīng)問(wèn)題開(kāi)辟了嶄新的途徑,并為其他器官移植提供了重要的理論依據(jù)。
目的研究人工全髖關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)后假體周圍組織的血管化程度,探討其與假體周圍骨溶解的關(guān)系。 方法取2009年10月-2012年6月22例(22髖)因假體無(wú)菌性松動(dòng)行髖關(guān)節(jié)翻修術(shù)患者假體周圍界膜組織,其中男12例,女10例;年齡53~81歲;假體使用壽命6~14年。術(shù)中根據(jù)假體周圍標(biāo)準(zhǔn)分區(qū)法,結(jié)合術(shù)前影像學(xué)表現(xiàn),將假體周圍界膜組織分為骨溶解區(qū)組和非骨溶解區(qū)組。另取同期8例(8髖)行人工全髖關(guān)節(jié)置換的骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織作為對(duì)照組,其中男3例,女5例;年齡58~72歲。行HE染色觀察組織學(xué)特征,根據(jù)骨溶解區(qū)組金屬或聚乙烯顆粒數(shù)量行磨損程度分級(jí)。采用CD34免疫組織化學(xué)染色對(duì)組織內(nèi)的血管進(jìn)行標(biāo)記,計(jì)算微血管密度及微血管指數(shù),比較不同組間血管化程度以及不同磨損程度下血管化程度的變化。 結(jié)果組織學(xué)觀察骨溶解區(qū)組界膜組織中可見(jiàn)磨損顆粒聚集以及單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)廣泛,非骨溶解區(qū)組以纖維細(xì)胞為主。免疫組織化學(xué)染色示,非骨溶解區(qū)組微血管密度和微血管指數(shù)較骨溶解區(qū)組和對(duì)照組顯著降低(P<0.05);骨溶解區(qū)組以上指標(biāo)較對(duì)照組低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。金屬、聚乙烯顆粒重度磨損組織微血管密度和微血管指數(shù)均較對(duì)應(yīng)的輕度磨損組織明顯減少(P<0.05);相同磨損程度時(shí),聚乙烯磨損顆粒以上指標(biāo)均較金屬磨損顆粒高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論界膜組織內(nèi)單核細(xì)胞發(fā)揮吞噬功能需要一定數(shù)量的微血管和血供,假體-骨界面組織微血管損傷或者血供減少,可能是造成假體周圍骨整合不良和假體無(wú)菌性松動(dòng)的重要原因。
體外分離培養(yǎng)豬滑膜源性MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs),探討其在體外多向分化潛能。 方法 2 月齡長(zhǎng)楓雜交豬3 頭,雌雄不限,體重8 ~ 10 kg。取豬膝關(guān)節(jié)滑膜組織分離SMSCs 并行原代及傳代培養(yǎng),待第3 代SMSCs 長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后,吸去基礎(chǔ)培養(yǎng)液,分別加入特定培養(yǎng)液進(jìn)行成軟骨、成骨、成脂誘導(dǎo)分化,作為實(shí)驗(yàn)組;以基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對(duì)照組。成軟骨誘導(dǎo)21 d 后行甲苯胺藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè);成骨誘導(dǎo)10 d 后行ALP 染色檢測(cè),21 d 后行茜素紅染色檢測(cè);成脂誘導(dǎo)21 d 后行油紅O 染色檢測(cè)。 結(jié)果 SMSCs 培養(yǎng)24 h后細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)或呈多角形;48 h 后細(xì)胞數(shù)量增多;72 h 后可見(jiàn)大量紡錘形細(xì)胞,其間散在分布少許小圓形細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組成軟骨誘導(dǎo)21 d 后甲苯胺藍(lán)染色呈陽(yáng)性,細(xì)胞外有蛋白多糖(Aggrecan)形成;免疫組織化學(xué)染色示特異軟骨基質(zhì)Col Ⅱ表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。成骨誘導(dǎo)10 d 后ALP 染色陽(yáng)性,21d 后茜素紅染色陽(yáng)性,有鈣結(jié)節(jié)形成。成脂誘導(dǎo)21 d 后油紅O 染色示細(xì)胞內(nèi)有脂滴形成。對(duì)照組除ALP 染色觀察呈弱陽(yáng)性外,余染色均呈陰性。 結(jié)論 豬膝關(guān)節(jié)滑膜組織可分離獲取SMSCs,其在體外具有向成軟骨、成骨、成脂多向分化潛能,有望成為組織工程種子細(xì)胞來(lái)源。
【摘 要】 目的 評(píng)價(jià)HA 復(fù)合rhBMP-2 的腺病毒(adenovirus mediated rhBMP-2,Adv-rhBMP-2)轉(zhuǎn)染的羊BMSCs 對(duì)骨痂延長(zhǎng)骨愈合的影響。 方法 成年山羊19 只,雌雄不限,體重15 ~ 20 kg。于每只羊髂嵴上穿刺抽取骨髓10 mL,常規(guī)傳代培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs,以感染復(fù)數(shù)200 轉(zhuǎn)染腺病毒。取0.25% 胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后3 d 的細(xì)胞1 ×108 個(gè),與HA 充分混勻制備Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA。建立山羊右側(cè)脛骨延長(zhǎng)模型,術(shù)后立即于截骨部位注射自體細(xì)胞復(fù)合物。按術(shù)后注入物質(zhì)不同隨機(jī)分成4 組:A 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA 組(n=6),B 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs 組(n=5),C 組為Adv-β-gal/BMSCs/HA 組(n=4),D 組為空白組(n=4)。術(shù)后第7 天開(kāi)始行脛骨延長(zhǎng),速度1 mm/d,共延長(zhǎng)4 周。術(shù)后5、8、12 周攝X 線片觀察骨痂生長(zhǎng)情況,12 周處死動(dòng)物,取標(biāo)本分別行骨密度檢測(cè)、生物力學(xué)測(cè)定、組織學(xué)觀察和骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。 結(jié)果 X 線片檢查示,術(shù)后5、8 周A、B 組骨痂生成量明顯多于C、D 組,X 線片定量評(píng)分A、B 組明顯高于C、D 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);12 周各組均在骨延長(zhǎng)部位形成連續(xù)骨痂。骨密度測(cè)定:術(shù)后12 周A、B、C、D 組延長(zhǎng)部位骨礦物質(zhì)含量分別為(4.175 ± 1.921)、(2.600 ± 0.638)、(2.425 ± 0.826)和(1.175 ± 0.574) g,骨礦物質(zhì)密度分別為(0.612 ± 0.196)、(0.630 ± 0.159)、(0.450 ± 0.166)和(0.266 ± 0.113)g/cm2,A、B 組顯著高于C、D組(P lt; 0.05)。生物力學(xué)測(cè)定:A、B、C、D 組最大載荷分別為(490.20 ± 155.08)、(350.59 ± 80.48)、(221.95 ± 68.79)和(150.65 ± 92.29)N,彈性模量為(178.24 ± 105.80)、(105.88 ± 27.09)、(81.18 ± 48.67)和(50.35 ± 47.64)MPa,各指標(biāo)A組顯著高于C、D 組(P lt; 0.05)。組織學(xué)觀察見(jiàn)A 組骨延長(zhǎng)處大量新生骨組織,骨小梁多為縱行網(wǎng)狀排列。骨形態(tài)計(jì)量分析示A、B、C、D 組新骨體積分別為72.35% ± 5.68%、67.58% ± 7.42%、49.63% ± 4.87% 和38.87% ± 2.35%,A 組新生骨生成量明顯比D 組多(P lt; 0.05)。 結(jié)論 HA 復(fù)合rhBMP-2 修飾的BMSCs 制備的組織工程骨可促進(jìn)羊脛骨延長(zhǎng)骨愈合。
構(gòu)建含人IL-1 受體拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(PLXRNIL-1Ra),體外轉(zhuǎn)染人骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)軟骨細(xì)胞,研究其相關(guān)特性。 方法 利用細(xì)菌內(nèi)同源重組技術(shù)快速構(gòu)建PLXRN-IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序及酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)染PT67 細(xì)胞,包裝成為重組PLXRN-IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒,并使用小鼠腎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3 對(duì)病毒進(jìn)行滴度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)分為3 組:未轉(zhuǎn)染組(A 組)、PLXRN 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(B 組)、PLXRN-IL-1Ra 轉(zhuǎn)染組(C 組),病毒感染人OA 軟骨細(xì)胞后,RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-1Ra 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá);ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中人IL-1Ra 蛋白表達(dá)。 結(jié)果 酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中含有人IL-1Ra cDNA,測(cè)定包裝的病毒滴度為3 × 104 CFU/mL。原代軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)呈多角形或梭形,甲苯胺藍(lán)染色見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有紫色異染顆粒。RT-PCR 結(jié)果顯示在C 組出現(xiàn)311 bp 人IL-1Ra mRNA 片段,A、B 組未見(jiàn)人IL-1Ra mRNA 的表達(dá)帶,GAPDH 在各組均有表達(dá)。ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C 組細(xì)胞上清有一定量的人IL-1Ra 表達(dá),蛋白濃度為(60.47 ± 15.13)ng/L,A 組和B 組均無(wú)人IL-1Ra 表達(dá)。 結(jié)論 構(gòu)建的IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體成功地感染人OA 軟骨細(xì)胞,并在體外獲得穩(wěn)定表達(dá),為將表達(dá)人IL-1Ra 基因的人OA 軟骨細(xì)胞用于OA 基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。