隨著對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的深入研究和抗VEGF藥物的研發(fā)，新生血管性老年性黃斑變性治療領(lǐng)域有了突破性進展。抗VEGF藥物治療新生血管性老年性黃斑變性的主要途徑是玻璃體腔注射。任何一種新興療法的應(yīng)用都要建立在可靠的安全性研究基礎(chǔ)上?？筕EGF藥物玻璃體腔注射的不良反應(yīng)主要分為藥物相關(guān)和注射相關(guān)不良反應(yīng)。其中，眼部不良反應(yīng)主要有眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜裂孔、眼壓升高、白內(nèi)障等；全身不良反應(yīng)主要有心肌梗死、卒中、尿路感染、高血壓、鼻咽炎、咽痛、前列腺癌、骨關(guān)節(jié)炎、腹股溝疝等。與貝伐單抗（bevacizumab，商品名Avastin）比較，雷珠單抗（ranibizumab，商品名Lucentis）具有較低的不良反應(yīng)發(fā)生率，其全身不良反應(yīng)不明顯。基于藥物的安全性差異還有待于更大規(guī)模臨床試驗來證實。
目的 觀察糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)對循環(huán)外周血內(nèi)皮祖細胞（EPCs）的影響。方法 雄性成年Wistar大鼠60只，隨機分為正常對照組和糖尿病組。后者通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立DR模型。采用流式細胞儀分別計數(shù)建模后1周、1、3、6個月各組大鼠循環(huán)外周血EPCs數(shù)量，同時于各相應(yīng)時間點摘除大鼠眼球行蘇木精伊紅(HE)染色、視網(wǎng)膜血管消化鋪片過碘酸Schiff(PAS)染色，通過光學(xué)顯微鏡以及透射電子顯微鏡進行視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查。對比分析EPCs數(shù)量以及EPCs數(shù)量與DR形態(tài)學(xué)變化的相互關(guān)系。結(jié)果 大鼠注射STZ 1周、1、3、6個月后循環(huán)外周血EPCs數(shù)量分別為(25plusmn;7)、(28plusmn;8)、(39plusmn;7)、(43plusmn;7)個/20萬個單個核細胞，對照組為(45plusmn;4)個/20萬個單個核細胞。與正常對照組大鼠相比，糖尿病組EPCs數(shù)量均降低（F=8.933，P＜0.01）。隨著觀察時間的延長，糖尿病組EPCs數(shù)量逐漸回升，而視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)、光感受器細胞、血管也逐漸出現(xiàn)病理性改變。光學(xué)顯微鏡下，與正常對照組比較，大鼠注射STZ后1周和1個月組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰完整，但厚度開始變薄，1個月組視網(wǎng)膜細胞排列紊亂，細胞核腫脹、體積增大，光感受器細胞減少，隨病程時間增加這些改變逐漸加重，3、6個月組視網(wǎng)膜厚度更薄，細胞排列紊亂更加明顯，部分擴張的血管有向外突出、破潰的趨勢。透射電子顯微鏡下，毛細血管內(nèi)皮細胞水腫，線粒體腫脹；毛細血管基底膜增厚，管腔狹窄，6個月組甚至出現(xiàn)管腔閉塞和視網(wǎng)膜微動脈瘤；光感受器細胞膜盤間隙擴大，排列紊亂，線粒體水腫，細胞早期空泡變性。結(jié)論 糖尿病大鼠外周血EPCs數(shù)量較正常大鼠降低。隨著DR的進展，EPCs數(shù)量逐漸回升。
目的觀察p21活化激酶4（PAK4）對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞行為和線粒體功能的影響。方法實驗研究，分為體內(nèi)動物實驗和體外細胞實驗兩部分。體內(nèi)動物實驗：健康C57BL/6J雄性小鼠12只，隨機分為正常對照組、糖尿病組，每組各6只小鼠。糖尿病組小鼠經(jīng)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病模型。建模后8周，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測正常對照組、糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜PAK4表達情況。體外細胞實驗：人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（hRMEC）分為常規(guī)培養(yǎng)細胞組（N組）、空載體組（Vector組）、PAK4過表達組（PAK4組）。各組加入150 μg/ml糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)細胞。細胞劃痕實驗檢測各組hRMEC內(nèi)細胞遷移情況；流式細胞儀檢測各組白細胞粘附于hRMEC數(shù)量。Seahorse XFe96細胞能量代謝分析儀測定細胞內(nèi)線粒體基礎(chǔ)呼吸、三磷酸腺苷（ATP）生成、最大呼吸與備用呼吸能力。兩組間比較采用t檢驗；三組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果體內(nèi)動物實驗：與正常對照組小鼠比較，糖尿病組小鼠視網(wǎng)膜中PAK4 mRNA、蛋白相對表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.372、22.419、25.372，P＜0.05）。體外細胞實驗：與N組、Vector組比較，PAK4組hRMEC中PAK4蛋白、mRNA相對表達量和細胞遷移率均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.821、38.692、29.421，P＜0.05）。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，PAK4組hRMEC上白細胞粘附數(shù)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.649，P＜0.01）。線粒體壓力測量結(jié)果顯示，PAK4組hRMEC內(nèi)線粒體基礎(chǔ)呼吸、ATP生成、最大呼吸與備用呼吸能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=27.472、22.315、31.147、27.472，P＜0.05）。結(jié)論PAK4高表達損傷線粒體功能并顯著促進白細胞粘附和內(nèi)皮細胞遷移。
目的觀察二甲雙胍（Met）對糖尿病（DM）微環(huán)境下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（hRMEC）中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體及細胞焦亡的影響。方法實驗研究，分為體內(nèi)動物實驗和體外細胞實驗進行。體內(nèi)動物實驗：健康C57BL/6J雄性小鼠9只，隨機分為DM組、正常對照組、DM+Met處理組（DM+Met組），每組各3只小鼠。DM組、DM+Met組小鼠經(jīng)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立DM模型；DM+Met組給予Met 400 mg/（kg·d）干預(yù)。建模后8周，免疫組織化學(xué)染色觀察正常對照組、DM組、DM+Met組小鼠視網(wǎng)膜NLRP3、cleaved-膜穿孔蛋白D（GSDMD）、cleaved-半胱天冬酶1（Caspase-1）的表達。體外細胞實驗：hRMEC分為常規(guī)培養(yǎng)細胞組（N組）、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）組、AGE+Met組。AGE組、AGE+Met組加入150 μg/ml AGE誘導(dǎo)細胞，AGE+Met組另加入2.0 mmol/L Met處理細胞。流式細胞儀檢測各組細胞焦亡情況；2', 7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針檢測各組細胞中活性氧（ROS）表達；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組細胞中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA、蛋白相對表達量。三組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果體內(nèi)動物實驗：與DM組比較，正常對照組、DM+Met組小鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達顯著降低；三組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=43.478、36.643、24.464，P＜0.01）。體外細胞實驗：流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，AGE組細胞焦亡率顯著高于N組、AGE+Met組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.598，P＜0.01）。DCFH-DA檢測結(jié)果顯示，N組、AGE+Met組細胞內(nèi)ROS水平較AGE組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=47.267，P＜0.01）。AGE+Met組細胞中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的mRNA（F=51.563、32.192、44.473，P＜0.01）和蛋白（F=63.372、54.463、48.412，P＜0.01）相對表達量較N組顯著下降。結(jié)論Met可下調(diào)hRMEC內(nèi)NLRP3炎性小體相關(guān)因子表達并抑制細胞焦亡。
目的觀察高糖狀態(tài)下NDRG1對恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（RF/6A細胞）增殖、遷移和管腔形成能力的影響。方法 將RF/6A細胞分為正常組、甘露醇組、高糖組、無靶基因的小干擾RNA（siRNA）陰性對照組（siRNA組）、30 nmol/L siRNA下調(diào)NDRG1基因組（siNDRG1組）、50 nmol/L siNDRG1組。正常組細胞常規(guī)培養(yǎng)；甘露醇組細胞加入25 mmol/L甘露醇培養(yǎng)；高糖組細胞加入25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)；siRNA組細胞加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA誘導(dǎo)培養(yǎng)；30、50 nmol/L siNDRG1組細胞均加入25 mmol/L葡萄糖，再分別用30、50 nmol/L siNDRG1進行誘導(dǎo)。所有細胞均孵育24 h進行后續(xù)實驗。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色觀察細胞增殖；細胞計數(shù)試劑盒8染色檢測細胞活性；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測細胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表達水平；細胞劃痕實驗觀察細胞遷移；細胞管腔形成實驗檢測管腔形成。兩組間比較采用雙尾Student t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果高糖組與正常組、甘露醇組細胞增殖率（t=36.659、57.645）、遷移率（t=24.745、33.638）、管腔形成數(shù)量（t=41.276、22.867）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與正常組、甘露醇組比較，高糖組細胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=46.145、21.541、36.738、32.976，P＜0.001）。與siRNA組比較，30 nmol/L siNDRG1組、50 nmol/L siNDRG1組細胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相對表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=44.275、40.7577、57.167、25.877，P＜0.01）。與正常組、siRNA組比較，30 nmol/L siNDRG1組細胞遷移率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=57.562、49.522，P＜0.01）。與正常組、siRNA組比較，30 nmol/L siNDRG1組相同視野下細胞管腔形成數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=63.446、42.742，P＜0.01）。結(jié)論下調(diào)NDRG1基因可誘導(dǎo)高糖狀態(tài)下RF/6A細胞活性、細胞遷移和管腔形成能力的提高。
目的觀察聚嘧啶束結(jié)合蛋白相關(guān)剪接因子（PSF）高表達對糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)下RPE細胞損傷的保護作用。方法將體外培養(yǎng)的人RPE細胞分為正常對照組（N組）、空白對照組（N+AGAGEs組）、空載體對照組（Vec+AGEs組）、PSF高表達組（PSF+AGEs組）。N組RPE細胞常規(guī)培養(yǎng)；N+AGEs組只做轉(zhuǎn)染處理但不導(dǎo)入任何外源性基因的RPE細胞聯(lián)合AGEs誘導(dǎo)；Vec+AGEs組、PSF+AGEs組利用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000將pcDNA空載體或pcDNA-PSF真核表達質(zhì)粒導(dǎo)入RPE細胞聯(lián)合AGEs誘導(dǎo)。除N組以外，其余3組細胞進行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染處理，24 h后應(yīng)用150 μg/ml的AGEs刺激72 h。采用HE染色和Hoechst 33258染色觀察PSF高表達對RPE細胞凋亡相關(guān)形態(tài)改變的影響；通過ROS水平檢測分析PSF高表達對AGEs誘導(dǎo)的RPE細胞ROS表達的影響；采用MTT比色法檢測PSF高表達對RPE細胞生存力的影響；采用Western blot檢測PSF不同作用時間及不同劑量對血紅素氧合酶1（HO-1）表達的影響。結(jié)果HE染色和Hoechst 33258染色觀察發(fā)現(xiàn)，N組細胞形態(tài)飽滿，細胞核呈圓形，細胞質(zhì)豐富，染色均一；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞體積縮小，嗜酸性染色增強，細胞核致密濃染、固縮甚至碎裂；PSF+AGEs組細胞形態(tài)尚飽滿，細胞漿染色較均勻，細胞核染色均一。MTT比色法檢測結(jié)果顯示，PSF高表達可有效提高RPE細胞生存力，但該作用可被ZnPP有效拮抗，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=33.26，P＜0.05）。DCFH-DA法檢測結(jié)果顯示，與N+AGEs組、Vec+AGEs組比較，PSF+AGEs組細胞中ROS產(chǎn)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.94，P＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示，PSF蛋白以時間、劑量依賴性的方式上調(diào)HO-1的表達水平。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相對表達水平較0 h明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=164.91，P＜0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下的HO-1相對表達水平較0.0 μg明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=104.82，P＜0.05）。結(jié)論PSF可能通過上調(diào)HO-1的表達而抑制ROS產(chǎn)生，從而對AGEs誘導(dǎo)下的RPE細胞損傷發(fā)揮保護作用。
目的觀察慢病毒介導(dǎo)聚嘧啶束結(jié)合蛋白相關(guān)剪接因子（PSF）對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變（OIR）小鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用。方法5日齡C57BL/6J小鼠112只隨機分為正常對照組、單純OIR模型組、OIR模型+慢病毒空載體處理組（以下簡稱Vec組）及OIR模型+ PSF慢病毒處理組（以下簡稱PSF組），分別為16、32、32、32只。小鼠7日齡時，正常對照組小鼠常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)；單純OIR模型組、Vec組及PSF組小鼠建立OIR模型。小鼠12日齡時，Vec組、PSF組小鼠玻璃體腔分別注射滴度為1×1011 TU/ml的空載體病毒或PSF慢病毒1 μl。正常對照組和單純OIR模型組小鼠不再做任何處理。小鼠17日齡時，采用HE染色計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核；作視網(wǎng)膜鋪片，測量各組小鼠視網(wǎng)膜無灌注區(qū)相對面積；采用實時定量PCR檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）和血紅素氧合酶1（HO-1）的mRNA相對表達量；采用Western blot檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相對表達量。組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果正常對照組、單純OIR模型組、Vec組、PSF組小鼠突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)分別為0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09個；視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積分別為0.00%、（35.71±2.81）%、（36.57±4.53）%、（15.33±4.75）%。4組間小鼠突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)及視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.87、165.70，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組較正常對照組突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)增多，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積增大；PSF組較單純OIR模型組、Vec組突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)減少，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實時定量PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，4組間小鼠視網(wǎng)膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量（F=53.66、83.54）以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量（F=58.38、52.69、24.79）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網(wǎng)膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較正常對照組明顯降低，PSF組小鼠視網(wǎng)膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較單純OIR模型組、Vec組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的PSF可通過上調(diào)Nrf2及HO-1的表達抑制OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成。
目的觀察多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白相關(guān)剪接因子（PSF）對缺氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（hRMECs）功能的影響。方法采用三質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建慢病毒顆粒（LV）-PSF。LV-PSF體外感染hRMECs后通過流式細胞計數(shù)法測定其感染效率。應(yīng)用實時定量PCR（RT-PCR）檢測經(jīng)LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表達水平。將實驗分為體內(nèi)和體外兩部分。體內(nèi)實驗：7日齡健康C57B/L6小鼠20只，采用隨機數(shù)字表法分為正常組、氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變（OIR）組、OIR+LV-空載體（Vec）組和OIR+LV-PSF組，每組5只。除正常組外，其余3組構(gòu)建OIR模型。OIR組除缺氧刺激外，不做其余處理。OIR+LV-Vec組和OIR+LV-PSF組小鼠分別玻璃體腔注射LV-Vec或LV-PSF。觀察LV-PSF對視網(wǎng)膜新生血管（RNV）形成的影響。體外實驗：將hRMECs分為正常組、缺氧組、空載組、PSF高表達組。正常組為正常體外培養(yǎng)的hRMECs；缺氧組為缺氧刺激3 h恢復(fù)正常培養(yǎng)條件24 h的hRMECs；空載組、PSF高表達組分別為用LV-Vec、LV-PSF感染48 h，再用缺氧刺激3 h恢復(fù)正常培養(yǎng)條件24 h的hRMECs。采用MTT比色法觀察PSF對細胞增生能力的影響。采用細胞劃痕實驗和Transwell遷移實驗觀察PSF對缺氧刺激下細胞遷移能力的影響。采用RT-PCR觀察各組細胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表達。結(jié)果成功構(gòu)建可穩(wěn)定高表達PSF的LV-PSF，流式細胞儀測定其感染效率為97%，RT-PCR測得經(jīng)LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明顯上調(diào)。體內(nèi)實驗：OIR組、OIR+LV-Vec組小鼠RNV面積較正常組明顯增加（t=18.31、43.71），OIR+LV-PSF組小鼠RNV面積較OIR組（t=11.30）、OIR+LV-Vec組（t=15.47）明顯減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。體外實驗：MTT比色法檢測結(jié)果顯示，缺氧組hRMECs增生能力較正常組明顯增強（t=2.57），PSF高表達組hRMECs增生能力較正常組、缺氧組、空載組明顯降低（t=5.26、5.46、3.73），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，缺氧刺激3 h恢復(fù)正常條件24 h或48 h均可刺激缺氧組與空載組細胞明顯遷移（t=8.35、13.84，P＜0.05）；而與缺氧組與空載組比較，PSF高表達組細胞遷移不明顯（t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01，P＜0.05）。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，正常組和空載組微孔膜上染色的細胞數(shù)較多，而PSF高表達組微孔膜上染色的細胞數(shù)明顯減少（t=9.33、6.15，P＜0.05）。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，缺氧組、空載組hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表達明顯增加（t=15.23、21.09，P＜0.05），PSF mRNA表達無明顯變化（t=0.12、2.15， P＜0.05）；與缺氧組、空載組比較，PSF高表達組hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表達明顯下降（t=10.18、13.10，P＜0.05），PSF mRNA表達明顯增加（t=65.00、85.79，P＜0.05）。結(jié)論PSF可減少OIR模型小鼠RNV面積。PSF可能通過HIF-1α/VEGF信號通路抑制缺氧誘導(dǎo)的hRMECs增生和遷移。