目的 觀察表皮生長因子（EGF）誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞整合素alpha;5表達(dá)對細(xì)胞增生和遷移的影響。方法 在0.1、1.0、10.0、20.0、100.0 ng/ml EGF濃度條件下，體外培養(yǎng)人RPE細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及流式細(xì)胞術(shù)觀察不同濃度組整合素alpha;5 mRNA和蛋白的表達(dá)。后將實(shí)驗(yàn)分為Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）/Fv、DMEM/F12+10.0 ng/ml EGF、DMEM/F12+10.0 ng/mlEGF+兔抗人整合素alpha;5多克隆抗體（1∶100）及DMEM/F12+10.0 ng/ml EGF+兔抗人波形蛋白抗體（1∶100）組，采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法和Boyden小室法檢測細(xì)胞增生及遷移。結(jié)果 RT-PCR檢測顯示，細(xì)胞培養(yǎng)12 h，EGF對人RPE細(xì)胞整合素alpha;5 mRNA合成無明顯影響（F=0.618，P=0.687）；細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h，EGF能刺激人RPE細(xì)胞合成整合素alpha;5 mRNA，并呈濃度依賴性（F=465.303，212.340；P=0.000，0.000）。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，10.0 ng/ml組整合素alpha;5熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，與空白對照組和0.1 ng/ml組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MTT比色法和Boyden小室法檢測顯示，整合素alpha;5的表達(dá)促進(jìn)人RPE細(xì)胞增生和遷移。結(jié)論 EGF促進(jìn)整合素alpha;5 mRNA和蛋白的表達(dá)，整合素alpha;5的表達(dá)促進(jìn)人RPE細(xì)胞增生和遷移。
目的 觀察磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）在激光誘導(dǎo)的大鼠脈絡(luò)膜新生血管（CNV）中的表達(dá)，探討STAT3在CNV中可能的作用。方法 建立激光誘導(dǎo)的大鼠CNV模型，免疫熒光法觀察CNV生成早期磷酸化STAT3的表達(dá)。建立細(xì)胞缺氧模型，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Janus激酶2（JAK2）特異性阻斷劑AG490后培養(yǎng)1、3、6、12、24 h。流式細(xì)胞儀檢測視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞的增生指數(shù)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1alpha;（HIF-1alpha;）和VEGF的mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測HIF-1alpha;蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的含量。結(jié)果 激光光凝后3 d，磷酸化STAT3高表達(dá)于大鼠CNV區(qū)域。阻斷JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，缺氧條件下人RPE細(xì)胞隨時(shí)間增生指數(shù)明顯降低（t=1.472，3.566，2.391，6.420；P=0.054，0.038，0.042，0.016）。隨缺氧時(shí)間增加，HIF-1alpha;和VEGF mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)。采用AG490阻斷JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，缺氧條件下人RPE細(xì)胞HIF-1alpha; mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)、HIF-1alpha;蛋白的活化均受明顯抑制(t=0.07,0.02,0.01, P＜0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF含量顯著降低（t=1.330，1.106，2.828，7.742，5.610，6.894，P=0.082，0.063，0.014，0.002，0.016，0.011）。結(jié)論 STAT3可能參與了CNV的發(fā)生，這一過程部分是通過JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控RPE細(xì)胞HIF-1alpha;和VEGF表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
目的 探討在體電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞層和光感受器（PR）細(xì)胞層的可行性。方法 147只健康雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠根據(jù)電穿孔刺激模式電壓值分為5、10、15、20、25、30、35 V組，右眼視網(wǎng)膜下腔注射增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPN1為實(shí)驗(yàn)眼，左眼注射TE Buffer 為對照眼。各組根據(jù)不同轉(zhuǎn)染方向再分為RPE和PR兩個(gè)亞組。各組除電壓不同外，其余參數(shù)均為脈寬99 ms，脈沖間期0.5 s，連續(xù)5個(gè)脈沖。將帶有負(fù)電荷的質(zhì)粒在電場作用下，擬轉(zhuǎn)染到RPE細(xì)胞層，反向置電極，擬轉(zhuǎn)染到PR細(xì)胞層。轉(zhuǎn)染后7 d 取各組視網(wǎng)膜鋪片，熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)強(qiáng)弱、范圍及熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)分析；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）半定量觀察EGFP蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后7 d，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，各組RPE亞組對照眼RPE細(xì)胞層內(nèi)均未見特異性熒光表達(dá)，實(shí)驗(yàn)眼可見綠色熒光表達(dá)；各組RPE亞組對照眼視網(wǎng)膜鋪片均未見熒光表達(dá)，實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜鋪片均可見轉(zhuǎn)染了EGFP的RPE細(xì)胞。Western blot檢測顯示，隨電壓增加，EGFP蛋白與beta;-肌動(dòng)蛋白條帶灰度相對比值呈上升趨勢。RT-PCR檢測顯示，各組均產(chǎn)生陽性擴(kuò)增條帶，隨電壓增高，EGFP mRNA與GADPH mRNA擴(kuò)增條帶灰度相對比值逐漸增高。結(jié)論 在體電穿孔方法可以有效輔助基因轉(zhuǎn)染大鼠RPE細(xì)胞層。
目的 觀察中藥銀杏葉提取物對光損傷后視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探討銀杏葉提取物保護(hù)RPE光損傷的分子機(jī)制。方法 生長良好的人RPE細(xì)胞（ARPE-19）融合生長到80%時(shí)，隨機(jī)分為正常對照組、光損傷組和銀杏葉提取物處理組。運(yùn)用冷白光以（2200±300） lx光照ARPE-19，建立光損傷模型；以100 μg/ml的銀杏葉提取物（EGb761）處理光損傷的RPE細(xì)胞。提取細(xì)胞可溶性蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳，ImageMaster 凝膠軟件分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并選取表達(dá)差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析。結(jié)果 蛋白圖譜差異分析顯示，光損傷組與正常對照組比較，差異蛋白質(zhì)有33個(gè)，其中蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)10個(gè)，蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào) 23個(gè)；銀杏葉提取物處理組與光損傷組差異蛋白質(zhì)有25個(gè)，其中，蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)3個(gè)，蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)22個(gè)。銀杏葉提取物處理組與正常對照組比較，差異蛋白質(zhì)有11個(gè)，其中，蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)4個(gè)，蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)7個(gè)。差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和生物信息分析，成功鑒定出16個(gè)蛋白，包括組織蛋白酶B、熱休克蛋白、細(xì)胞色素C還原酶等。結(jié)論 光損傷RPE細(xì)胞與銀杏葉提取物處理后的光損傷RPE細(xì)胞及正常RPE細(xì)胞間的蛋白質(zhì)表達(dá)有差異；銀杏葉提取物光損傷保護(hù)作用涉及組織蛋白酶B、熱休克蛋白、細(xì)胞色素C還原酶等多種蛋白。
目的 探討體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSCs）向視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞分化的可行性。方法 采用貼壁篩選法分離、培養(yǎng)Brown-Norway(BN) rMSCs。將反復(fù)凍融制成的BN大鼠RPE細(xì)胞裂解液加入到rMSCs培養(yǎng)體系中，鑒定被誘導(dǎo)的細(xì)胞是否同時(shí)表達(dá)RPE細(xì)胞的特征性標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白（CK）與S-100。結(jié)果 經(jīng)RPE細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)的rMSCs生長速度減慢，細(xì)胞呈長梭形，周邊有毛刺樣突起。免疫印跡法和雙重免疫熒光標(biāo)記顯示部分經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CK與S100。流式細(xì)胞術(shù)顯示14.1%的細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)CK與S-100。結(jié)論 rMSCs經(jīng)RPE細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)后能夠向RPE細(xì)胞方向分化。
虹膜色素上皮（IPE）細(xì)胞是一種胚胎發(fā)育與視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞同源的生長細(xì)胞，不僅在結(jié)構(gòu)上與RPE細(xì)胞有著驚人的相似之處，而且在吞噬視桿細(xì)胞外節(jié)段和分泌細(xì)胞因子等功能方面也有顯著一致性。利用基因轉(zhuǎn)染等方法將IPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下腔不僅可以應(yīng)用于遺傳性視網(wǎng)膜變性，老年性相關(guān)變性等眼科疾病的治療，同時(shí)還可以應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療。關(guān)注IPE細(xì)胞的功能特性及其移植方法的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景具有重要的臨床意義?，F(xiàn)就IPE細(xì)胞的功能特性及研究進(jìn)展作一綜述。
目的 觀察視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞中黑色素含量與光感受器細(xì)胞功能之間的關(guān)系，探討黑色素對視網(wǎng)膜光損傷的作用。方法 老齡多巴色素異構(gòu)酶敲除小鼠（Dct-/-小鼠）和C57BL/6小鼠（野生型小鼠）各20只，分別為Dct-/-小鼠組和野生型小鼠組。采用臨床電生理國際標(biāo)準(zhǔn)分別對各型鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢查，記錄其最大混合反應(yīng)后各組隨機(jī)處死2只小鼠，摘除眼球作為陰性對照。余下每組各18只小鼠，將6只小鼠用20 W冷熒光燈行12 h明、12 h暗、12 h明的間斷光照36 h，連續(xù)3個(gè)循環(huán)。光照強(qiáng)度為（5000plusmn;356） lx。光照結(jié)束后第6天再次進(jìn)行ERG檢查，記錄ERG結(jié)果。隨機(jī)頸椎脫臼法處死每組各2只小鼠，摘除眼球。所有摘除眼球常規(guī)組織切片，光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察。結(jié)果 ERG檢查結(jié)果顯示，光損傷前后Dct-/-小鼠a、b波振幅明顯低于野生型小鼠（ta波光照前=-7.13，P＜0.01；tb波光照前=-4.414，P＜0.01；ta波光照后=-10.162，P＜0.01；tb波光照后=-6.772，P＜0.01）；光損傷后Dct-/-小鼠ERG a、b波的振幅下降幅度明顯高于野生型小鼠（ta波=4.975,P＜0.01；tb波=2.908,P＜0.01）。光損傷后，光學(xué)顯微鏡檢查可見Dct-/-小鼠視網(wǎng)膜水腫、變薄，較野生型明顯；電子顯微鏡檢查可見RPE細(xì)胞中黑色素顆粒融解、斷裂或丟失，光感受器細(xì)胞外節(jié)盤膜腫脹、碎裂及空泡變，Dct-/-小鼠損傷較野生型小鼠嚴(yán)重。結(jié)論 光損傷后RPE細(xì)胞黑色素含量減少，光感受器細(xì)胞功能下降，提示黑色素對光損傷可能有保護(hù)作用。
目的 探討藍(lán)光光照強(qiáng)度、時(shí)間與大鼠視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞復(fù)制衰老的關(guān)系。方法 將36只鼠齡12~14周的Wistar大鼠置于懸有波長為（450plusmn;10） nm的醫(yī)用藍(lán)光燈管的自制光照架中。隨機(jī)分為4組，每組9只大鼠，1組：無光照對照組；2組：自然光照組；3組：500 lx光照組；4組：1000 lx光照組。每組按照照射時(shí)間再分為1、2、3個(gè)月組3個(gè)亞組，分別在1、2、3個(gè)月時(shí)行10％水合氯醛腹腔注射麻醉后取出眼球，將右眼球行石蠟切片，蘇木精伊紅（HE）染色；左眼球行冰凍切片，采用衰老相關(guān)beta;半乳糖苷酶（SA-beta;-Gal）染色方法觀察RPE細(xì)胞染色陽性情況。采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 不同光照強(qiáng)度組、不同光照時(shí)間組大鼠RPE 細(xì)胞SA-beta;-Gal染色陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝510.309，55.016；P＝0.000）；組間兩兩比較，除1組與2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＝0.154），其它各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）。在單一光照強(qiáng)度條件下，除1組大鼠RPE細(xì)胞SA-beta;-Gal染色陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P=0.897）,其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在單一時(shí)間條件下，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）。結(jié)論 同一藍(lán)光光照強(qiáng)度下，隨著時(shí)間的增加大鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞逐漸出現(xiàn)復(fù)制衰老改變;同一時(shí)間條件下，隨光照強(qiáng)度增加大鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞也逐漸出現(xiàn)復(fù)制衰老改變。