目的 構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β3（transforming growth factor β3，TGF-β3）的腺病毒載體，并通過(guò)腺病毒載體將TGF-β3基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs），使其在細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)。方法 將人TGF--3質(zhì)粒定向克隆進(jìn)入穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV中，與pAdEasy1共同轉(zhuǎn)入細(xì)菌并重組，獲得TGF-β3重組腺病毒質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法導(dǎo)入包裝細(xì)胞HEK293中，48～96 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。取1 月齡新西蘭大白兔5 只，取其脛骨骨髓。采用密度梯度離心法分離純化MSCs，并進(jìn)行傳代。取傳至第3代細(xì)胞采用TGF-β3腺病毒載體轉(zhuǎn)染，10 h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染TGF-β3重組腺病毒4d后的MSCs用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察TGF-β3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果 pAdEasy-TGF-β3轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞48~96 h后，熒光顯微鏡可見(jiàn)明顯的綠色熒光表達(dá)。 兔骨髓分離培養(yǎng)10 d 后，培養(yǎng)MSCs融合達(dá)70％~80%、貼壁緊密，細(xì)胞形態(tài)均一，似成纖維細(xì)胞；14 d 完成原代細(xì)胞培養(yǎng)。TGF-β3重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs 17 h 后，熒光顯微鏡下出現(xiàn)少量綠色熒光，48~72 h 熒光加強(qiáng)，熒光與MSCs輪廓一致。免疫細(xì)胞化學(xué)觀察，轉(zhuǎn)染TGF-β3重組腺病毒MSCs胞漿內(nèi)有棕黃色陽(yáng)性顆粒表達(dá)。結(jié)論 TGF-β3基因重組腺病毒載體的成功構(gòu)建并在MSCs內(nèi)的表達(dá)，為創(chuàng)傷愈合的基因治療提供了研究基礎(chǔ)。
【摘 要】 目的 通過(guò)將轉(zhuǎn)染TGF-β3c2s2 基因的兔BMSCs 移植于兔耳瘢痕模型，觀察轉(zhuǎn)基因BMSCs 對(duì)創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕形成的影響。 方法 成年健康日本大耳白兔20 只，體重1.7 ～ 2.5 kg，雌雄不拘。取第3 代兔BMSCs，經(jīng)Ad-TGF-β3c2s2 在感染復(fù)數(shù)150 下轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)孵育24 h 后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL 備用。將純化、濃縮的Ad-TGF-β3c2s2顆粒，DMEM/F12（不含F(xiàn)BS）稀釋為1×108 pfu/mL 備用。于20 只日本大耳白兔雙側(cè)兔耳分別制備兩個(gè)2 cm × 2 cm 大小的腹側(cè)全層皮膚、軟骨缺損創(chuàng)面。將每只兔的4 個(gè)創(chuàng)面隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組）、Ad-TGF-β3c2s2 組（B組）、BMSCs 組（C組）和BMSCs/Ad-TGF-β3c2s2 組（D 組），并以自身正常皮膚作為正常對(duì)照（E 組）。將備好的細(xì)胞及病毒液分別按創(chuàng)面分組進(jìn)行局部移植。于術(shù)后21、45、90 d 行大體觀察、瘢痕硬度和厚度測(cè)定、HE 染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果 大體觀察：A、B、C 組上皮化后創(chuàng)面均逐漸形成不同程度的瘢痕，傷后45 d 瘢痕增生程度達(dá)高峰，明顯高出皮膚表面，持續(xù)至90 d，D 組在觀察期內(nèi)均無(wú)明顯高出周?chē)つw的瘢痕形成。術(shù)后45 d 和90 d，A、B、C 組瘢痕厚度和硬度明顯高于D 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01），而B(niǎo) 組低于A、C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）；D 組愈合后創(chuàng)面厚度和硬度與正常皮膚接近。HE 染色觀察：A、C 組傷后45 d 可見(jiàn)淺層組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，膠原纖維粗大，呈交錯(cuò)網(wǎng)織狀排列；B 組和D組結(jié)構(gòu)與正常皮膚接近，但較E 組膠原排列致密，表皮較A、C 組薄；90 d 各組結(jié)構(gòu)與45 d 相似。BrdU 免疫組織化學(xué)觀察，傷后21、45 d，C、D 組均能見(jiàn)到散在分布、胞核染色陽(yáng)性的棕色細(xì)胞，A、B、E 組均為陰性。 結(jié)論 創(chuàng)面局部移植人TGF- β3c2s2 基因修飾的BMSCs，具有抑制創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕的作用。
目的 探討自體納米脂肪混合顆粒脂肪移植治療兒童輕度半側(cè)顏面短小畸形（hemifacial microsomia，HFM）面部軟組織發(fā)育不良的療效。方法 2016年7月—2020年12月，收治Pruzansky-Kaban Ⅰ型HFM患兒24例。其中采用自體納米脂肪混合顆粒脂肪（1∶1）移植12例（研究組），自體顆粒脂肪移植12例（對(duì)照組）。兩組患兒性別、年齡以及患側(cè)側(cè)別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。將患兒面部分為Ⅰ區(qū)（頦點(diǎn)-下頜角-口角）、Ⅱ區(qū)（下頜角-耳垂-鼻翼外側(cè)腳基點(diǎn)-口角）、Ⅲ區(qū)（耳垂-鼻翼外側(cè)腳基點(diǎn)-內(nèi)眥-耳輪腳），術(shù)前基于頜面部CT掃描+三維重建數(shù)據(jù)采用Mimics軟件計(jì)算3區(qū)健、患側(cè)軟組織容積差，以此確定自體脂肪抽取量及注射量。術(shù)前1 d及術(shù)后1年測(cè)量健、患側(cè)下頜角至口角距離（下頜角-口角）、下頜角至外眥距離（下頜角-外眥）、耳垂至鼻翼外側(cè)緣距離（耳垂-鼻翼外側(cè)緣）以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)軟組織容積，計(jì)算上述指標(biāo)健、患側(cè)差值，作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。術(shù)后1年患兒家長(zhǎng)、手術(shù)醫(yī)師及手術(shù)組護(hù)士三方，根據(jù)患兒手術(shù)前后正位照片評(píng)價(jià)手術(shù)滿意度。結(jié)果 研究組、對(duì)照組分別注射脂肪（28.61±8.59）、（29.33±8.08）mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.204，P=0.840）。注射后僅對(duì)照組1例皮下有少許脂肪鈣化硬結(jié)。兩組患兒均獲隨訪，隨訪時(shí)間均為1年～1年6個(gè)月，研究組平均1年4個(gè)月，對(duì)照組平均1年3個(gè)月。術(shù)后1年，兩組患兒健、患側(cè)不對(duì)稱(chēng)均改善，研究組患兒家長(zhǎng)、手術(shù)醫(yī)師及手術(shù)組護(hù)士三方滿意度均為100%（12/12），對(duì)照組滿意度分別為100%（12/12）、83%（10/12）、92%（11/12）。術(shù)后兩組下頜角-口角、下頜角-外眥、耳垂-鼻翼外側(cè)緣以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)軟組織容積的健、患側(cè)差值均小于術(shù)前（P<0.05）。兩組間術(shù)前上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；術(shù)后研究組各指標(biāo)均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 自體納米脂肪混合顆粒脂肪移植及自體顆粒脂肪移植均能改善兒童輕度HFM面部軟組織發(fā)育不良，但前者療效優(yōu)于后者。