目的 探討骨髓基質(zhì)細胞與生物活性玻璃陶瓷(BGC) 和聚乳酸(PLA) 的生物相容性,為骨組織工程中生物材料的選擇提供依據(jù)。方法 將骨髓基質(zhì)細胞與BGC、PLA 復合體外培養(yǎng),進行形態(tài)學觀察、細胞增殖、蛋白質(zhì)含量及酶學測定。結(jié)果 骨髓基質(zhì)細胞能在BGC、PLA 上貼附、繁殖,其生長及功能不受影響,并且BGC具有一定的促細胞增殖作用。結(jié)論 BGC、PLA 具有良好的細胞相容性,有可能作為骨髓基質(zhì)細胞的載體應用于組織工程的研究。
目的 比較全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法對hBMSCs 的分離效果。 方法 取健康成年人自愿捐贈的骨髓，分別采用全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離、培養(yǎng)hBMSCs 并進行傳代。采用倒置相差顯微鏡觀察原代細胞形態(tài)變化；取第2 代細胞培養(yǎng)7 d 后行HE 染色；對比原代及第2、3 代細胞傳代時間；流式細胞儀檢測表面標志物；并檢測細胞經(jīng)成骨誘導后3、6、9 d 的ALP 含量，于第9 天采用Kaplow 法染色觀察細胞ALP 染色情況。 結(jié)果 全骨髓培養(yǎng)法分離的原代細胞呈聚集樣生長，而密度梯度離心法分離的原代細胞呈單個、散在生長。HE 染色示兩種方法分離培養(yǎng)的第2 代細胞輪廓清晰，大小及形態(tài)均勻一致。全骨髓培養(yǎng)法原代細胞的傳代時間（15.36 ± 1.67） d；明顯快于密度梯度離心法的（18.57 ± 1.05）d，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；第2、3 代細胞的傳代時間兩種分離方法差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。經(jīng)流式細胞儀檢測，兩種方法培養(yǎng)的hBMSCs 上陽性表面標志物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166 含量和陰性表面標志物CD34 含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05），陰性表面標志物CD14、CD45 含量差異 有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。兩種方法分離的第2 代細胞經(jīng)成骨誘導后各時間點ALP 含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；成骨誘導后第9 天ALP 染色程度基本一致。 結(jié)論 全骨髓培養(yǎng)法可分離出hBMSCs，其分離效果與密度梯度離心法相似。
目的 通過檢測熒光微球655（quantum dot 655，QD655）標記SD 大鼠BMSCs 的體外細胞毒性、細胞增殖、細胞貼附性以及標記率，探討QD655 標記BMSCs 及其示蹤的可行性。 方法 收集2 周齡健康SD 大鼠股骨和脛骨骨髓，貼壁培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs 采用QD655 標記作為實驗組，以未標記BMSCs 作為對照組，采用錐蟲藍拒染法檢測細胞存活率，MTT 法觀察QD655 對細胞增殖性的影響；取實驗組BMSCs 向成骨誘導分化培養(yǎng)2 周，采用茜素紅、ALP 染色定性鑒定細胞成骨分化能力，實時熒光定量PCR 鑒定標記對細胞成骨分化的影響；分別在標記后即刻、1、2、4、6 周采用熒光顯微鏡動態(tài)檢測實驗組BMSCs 陽性標記率；掃描電鏡觀察實驗組細胞在膠原/ 生物活性玻璃復合材料上的貼附性。 結(jié)果 實驗組與對照組細胞存活率均gt;90%，比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；培養(yǎng)1、3、5、7、9 d，兩組細胞增殖率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。實驗組BMSCs 經(jīng)成骨誘導分化2 周后，茜素紅及ALP 染色均呈陽性，實時熒光定量PCR 檢測實驗組BMSCs 的骨橋蛋白、骨鈣素、Ⅰ型膠原、ALP、BMP-2 mRNA 較對照組成倍數(shù)高表達。實驗組BMSCs 標記后即刻陽性標記率達96.50% ± 1.59%，隨著標記時間延長標記率下降，標記后1、2、4、6 周標記率分別為93.30% ± 1.51%、72.40% ± 2.90%、40.10% ± 3.60%、10.00% ± 1.70%，對照組各時間點陽性標記率均為0。掃描電鏡觀察示實驗組標記后細胞和材料貼附良好。 結(jié)論 QD655 對大鼠BMSCs 標記時間長，標記率及安全性高，是一種良好標記 物。
目的 組織工程骨的神經(jīng)化能有效促進支架材料內(nèi)血管生成，修復骨缺損。研究降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖與遷移的作用，進一步揭示組織工程骨的神經(jīng)化促血管生成機制。 方法 體外分離獲取HUVECs，并通過血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）與CD31 抗原鑒定，取第1 代細胞用于實驗。實驗分為6 組，分別以0（A 組）、1 × 10—12（B 組）、1 × 10—11（C 組）、1 × 10—10（D 組）、1 × 10—9（E 組）、1 × 10—8 mol/L（F 組）濃度CGRP 干預HUVECs。采用細胞免疫熒光觀察HUVECs 的CGRP1 受體（CGRP1 receptor，CGRP1R）表達情況，AlarmarBlue 法動態(tài)檢測各組HUVECs 增殖率，Transwell 小室檢測各組HUVECs 的遷移能力，ELISA 法檢測HUVECs 分泌VEGF 的水平，Westernblot 法檢測其局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達。 結(jié)果 分離的細胞通過形態(tài)學及vWF、CD31 免疫熒光鑒定為HUVECs，并可見CGRP1R 在細胞質(zhì)和細胞膜表達。CGRP 呈時間- 濃度依賴性刺激HUVECs 增殖；B ～ F組各時間點細胞增殖能力均高于A 組（P lt; 0.05），F(xiàn) 組各時間點細胞增殖能力最高。B ～ F 組遷移細胞數(shù)均顯著高于A組（P lt; 0.05），最大增幅達3 倍以上。B ～ F 組VEGF 分泌量均顯著高于A 組（P lt; 0.05）；C、D 組促進細胞分泌VEGF 的能力最強。Western blot 檢測示，與A組相比，B～F組CGRP刺激HUVECs 3、7、10 d 后，F(xiàn)AK表達明顯增加（P lt; 0.05）。 結(jié)論 CGRP 對HUVECs 的增殖和遷移有直接促進作用，可能作用機制為CGRP 能促進VEGF 分泌和增加FAK 的表達。
目的 觀察外源性降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）在大鼠BMSCs 遷移中的作用及對VEGF、血管黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）表達的影響，探討CGRP 通過BMSCs促進血管生成的作用機制。 方法 全骨髓法分離、培養(yǎng)SD 大鼠BMSCs，采用Western blot 法于傳代培養(yǎng)1、2、3 周時檢測BMSCs 中CGRP 受體（CGRP receptor，CGRPR）蛋白的表達。使用濃度為1 × 10-8 mol/L 的CGRP 作用于BMSCs作為實驗組，單純BMSCs 作為對照組，在培養(yǎng)72 h 時采用細胞趨化實驗檢測CGRP 對BMSCs 遷移的影響；在培養(yǎng)1、3、5、7 d 采用實時熒光定量PCR 檢測CGRP 作用后VCAM-1 mRNA 的表達變化，采用免疫細胞化學染色、Western blot 法檢測CGRP 作用后VEGF 的表達變化。 結(jié)果 Western blot 檢測示BMSCs 穩(wěn)定表達CGRPR，2 周時表達最高。細胞趨化實驗顯示，實驗組CGRP 刺激后穿膜遷移細胞數(shù)（3.20 ± 1.77）個/HP，較對照組（1.11 ± 0.49）個/HP 明顯增多（t=4.230，P=0.001）。實時熒光定量PCR 檢測示，實驗組VCAM-1 mRNA 表達隨時間延長逐漸增加，7 d 時最高；實驗組3、5、7 d的VCAM-1 mRNA 表達量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。免疫細胞化學染色示，培養(yǎng)1、3 d 兩組均無陽性染色；培養(yǎng)5、7 d 實驗組VEGF 染色呈陽性，對照組無陽性染色。Western blot 檢測示，培養(yǎng)1、3 d 兩組均未檢測到VEGF蛋白表達；培養(yǎng)5、7 d 實驗組VEGF 蛋白表達量均明顯高于對照組（P lt; 0.05）；實驗組5 d 的VEGF 蛋白表達量明顯高于7 d（P lt; 0.05）。 結(jié)論 CGRP 能促進BMSCs 遷移及VEGF 表達，這可能是CGRP 調(diào)節(jié)骨內(nèi)部血流變化而影響骨代謝的機制之一。
目的 骨組織工程所使用的支架材料能否快速、有效地血管化是骨修復的關鍵。研究增強型生物活性玻璃/ 膠原復合材料對血管化的協(xié)同和促進作用，為構(gòu)建血管化組織工程骨修復骨缺損尋找適宜的支架材料。 方法 體外分離獲取人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），并通過血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）與CD34 抗原鑒定，取第1 代細胞用于實驗。將細胞接種于增強型生物活性玻璃/ 膠原復合材料上，掃描電鏡觀察細胞黏附情況。取細胞接種于增強型生物活性玻璃/ 膠原復合材料作為實驗組，等量細胞直接接種于培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)作為對照組，采用alarmarBlue 法動態(tài)檢測細胞增殖率，實時熒光定量PCR 檢測內(nèi)皮細胞相關基因VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體1（fms-related tyrosine kinase 1，F(xiàn)lt-1）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（kinase insert domain receptor，Kdr）的mRNA 表達。取SD 大鼠6 只，將支架材料包埋于大鼠股內(nèi)側(cè)皮下，實驗組采用增強型生物活性玻璃/ 膠原復合材料、中央軸向植入血管束，對照組采用非增強型生物活性玻璃/ 膠原復合材料，分別于植入5、10 d 取出，行冰凍切片并HE 染色動態(tài)觀察支架材料內(nèi)部的血管化狀態(tài)。 結(jié)果 分離的細胞通過形態(tài)學及vWF、CD34 免疫熒光鑒定為HU VECs。掃描電鏡示HUVECs 在支架材料上黏附較好。HUVECs 在實驗組支架材料上增殖明顯，在第3 天后細胞增殖率開始高于對照組，11 d 達到增殖平臺期時細胞數(shù)仍多于對照組（P lt; 0.05）。實時熒光定量PCR 檢測示，培養(yǎng)3 d 實驗組VEGF、Flt-1、Kdr 的mRNA 表達均顯著高于對照組（P lt; 0.05）。包埋大鼠皮下實驗可見，實驗組5、10 d 時植入的血管仍通暢，其周圍新生血管隨時間延長而增多，材料周緣可見宿主血管浸潤生長，但新生血管稀疏；對照組僅有纖維組織生長，10 d 時材料已大部分降解，組織難以長入。 結(jié)論 增強型生物活性玻璃/ 膠原復合材料在大鼠體內(nèi)外可促進血管化，可能適于作為構(gòu)建血管化組織工程骨的支架材料。