華西醫(yī)學(xué)期刊出版社
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  • 人Ⅰ型前膠原基因反義寡核苷酸對(duì)人增生性瘢痕裸鼠移植模型膠原合成的作用

    目的 人Ⅰ型前膠原基因(Col Ⅰ A1)反義寡核苷酸(antisense oligodeoxyneucleotide,ASODN)對(duì)體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有抑制膠原合成作用,擬進(jìn)一步探討Col Ⅰ A1 ASODN 對(duì)裸鼠移植模型體內(nèi)的人增生性瘢痕的膠原合成作用。 方法 SPF 級(jí)BALB/c-nunu 品系6 ~ 8 周齡雌性裸鼠60 只,體重約20 g;取行瘢痕切除手術(shù)患者自愿捐贈(zèng)的瘢痕組織塊去表皮后,移植至裸鼠背部肩胛內(nèi)側(cè)皮下,每只裸鼠移植1 塊,制備人增生性瘢痕裸鼠移植模型。將58 只成功制備模型的裸鼠根據(jù)處理方法不同,隨機(jī)分成3 組,于瘢痕移植2 周根據(jù)分組行經(jīng)皮穿刺瘢痕內(nèi)注射。A 組(n=20):5 μL 濃度為3 mmol/L Col Ⅰ A1 ASODN、3 μL 脂質(zhì)體、92 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基;B 組(n=20): 3 μL 脂 質(zhì)體、97 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基;C 組(n=18):100 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)最初2 周每天注射1 次,之后隔天1 次,至實(shí)驗(yàn)取材。注射后2、4、6 周,對(duì)存活裸鼠進(jìn)行瘢痕硬度測(cè)量后,處死裸鼠取瘢痕組織行膠原染色組織學(xué)觀察以及透射電鏡觀察;提取細(xì)胞總RNA 后行RT-PCR 測(cè)定Col Ⅰ A1 mRNA 相對(duì)含量;ELISA 法行Col Ⅰ A1 蛋白定量分析。 結(jié)果 注射后6 周內(nèi)17 只裸鼠死亡;共41 只裸鼠40 塊瘢痕組織符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),納入實(shí)驗(yàn);A、B、C 組各14、13、14 只。注射后2 周,3 組間瘢痕硬度比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05);4、6 周時(shí)A 組與B、C 組比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05),B、C 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。隨時(shí)間延長(zhǎng),組織學(xué)觀察示3 組Ⅲ型膠原表達(dá)上升,A 組最明顯,Ⅰ型膠原排列規(guī)則。透射電鏡觀察示A 組成纖維細(xì)胞退化,膠原纖維排列更趨于一致;B、C 組膠原纖維排列也逐漸規(guī)則。注射后2、4 周3 組間Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達(dá)量比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);6 周時(shí)A 組與B、C 組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05),B、C 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論 在人增生性瘢痕裸鼠移植模型的瘢痕內(nèi)注射Col Ⅰ A1 ASODN 可抑制Col Ⅰ A1 mRNA 及Ⅰ型膠原表達(dá),促進(jìn)瘢痕組織成熟、軟化,脂質(zhì)體可促進(jìn)該抑制效果。

    發(fā)表時(shí)間:2016-08-31 05:44 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 人Ⅰ型前膠原基因反義寡核苷酸抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原合成

    探討陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)Ⅰ 型前膠原基因(Col Ⅰ A1)反義寡核苷酸(antisense oligodeoxyneucleotide,ASODN)轉(zhuǎn)染對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Col Ⅰ A1 表達(dá)的影響。 方法 取患者自愿捐贈(zèng)瘢痕組織,采用組織塊法培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞并傳代。于6 孔板內(nèi)按32.25 × 104 個(gè)/ 孔的密度接種第4 代細(xì)胞,根據(jù)轉(zhuǎn)染液不同分為4 組:A 組為脂質(zhì)體加Col Ⅰ A1 ASODN,B 組為Col Ⅰ A1 ASODN,C 組為脂質(zhì)體,D 組為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后8 h,1、2、3、4 d 分別提取細(xì)胞總RNA,行RT-PCR 后測(cè)定Col Ⅰ A1 mRNA 表達(dá)量;胃酶消化法提取ECM 中Col Ⅰ A1 蛋白,ELISA 測(cè)定其濃度。 結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示條帶清晰,無(wú)雜帶、明顯的引物二聚體及拖尾現(xiàn)象。Col Ⅰ A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量:轉(zhuǎn)染后8 h,A 組小于B、C、D 組,B、C 組小于D 組,比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);B、C 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05);轉(zhuǎn)染后1 d,A、B 組小于C、D 組(P lt; 0.05),A、B 組間和C、D 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05) ;轉(zhuǎn)染后2 d,各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);轉(zhuǎn)染后3、4 d,A 組小于B、C、D 組,B 組小于C、D 組(P lt; 0.05),C、D 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。Col Ⅰ蛋白濃度:轉(zhuǎn)染后8 h,A組小于B、C、D 組,B、C 組小于D 組,比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05),B、C 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PP gt; 0.05);轉(zhuǎn)染后1 d,各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);轉(zhuǎn)染后2、3、4 d,A、B 組小于C、D 組,C 組小于D 組(P lt; 0.05),A、B 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論 Col Ⅰ A1 ASODN 抑制Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達(dá);陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為載體有增強(qiáng)效果,促進(jìn)ASODN 進(jìn)入細(xì)胞并在核內(nèi)分布。

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